蜂毒多肽对膀胱移行细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响

王 强，刘艳如，陈宇东，王领军，刘同伟，李春吾，苑海波

蜂毒多肽是蜜蜂毒素的主要成分，具有多种生物活性，有研究报道蜂毒多肽在体外对多种实验性肿瘤细胞有明显的杀伤作用［1-2］。膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，早期手术以及随后的放疗、化疗对身体伤害较大，患者生存率低，因此对其发生机制的研究及治疗新药物的研发是解决膀胱癌临床治疗的根本途径［3-7］。我们通过人膀胱癌T24细胞体外实验及裸鼠移植瘤模型，观察及探讨蜂毒多肽对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、侵袭及裸鼠膀胱癌细胞移植瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 蜂毒多肽(Sigma公司，美国)，胎牛血清、RPMI-1640培养基、二甲基亚砜(DMSO)和四甲基偶氮唑盐(MTT)(Amresco公司，美国)，Annexin V-FITC凋亡试剂盒(晶美公司)，流式细胞仪(Beckon Dickenson公司，美国)。

1.2 细胞来源及培养 人膀胱癌细胞株T24引自美国ATCC细胞库，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养，培养基为含10%标准胎牛血清的RPMI-1640培养基，0．2%胰蛋白酶消化传代。

1.3 MTT检测蜂毒多肽对膀胱癌细胞增殖的影响取对数生长期T24细胞，调整细胞浓度至2．5×104/ml，每孔200μl接种于96孔培养板内，培养24 h后更换新鲜培养基，设不加药的空白对照组及蜂毒多肽组，蜂毒多肽组分别加入终浓度为1、10、100 mg/ml的蜂毒多肽，各设6个复孔，分别在12、24和48 h后吸去上清，加入80μl含10%胎牛血清RPMI-1640培养液和5 g/L MTT溶液20μl，培养4 h后加入150μl DMSO，用酶标仪在570 nm波长下测定各孔吸光度值(A)，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=1－(实验组 A值/对照组 A值)。

1.4 流式细胞术检测膀胱癌细胞周期和细胞凋亡选择48 h各组细胞进行检测，收集细胞用70%冷乙醇固定，4℃保存过夜。调整细胞浓度为1×106/ml，取1 ml细胞悬液，用PBS洗3次，加入10 g/L RNA酶溶液200μl，37℃水浴15 min，按试剂盒说明先加AnnexinV-FTTC液10μl孵育，再加入碘化丙锭10μl(终浓度为5 g/L)，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测分析。

1.5 Transwell小室法测定细胞侵袭力 将2×105/ml单细胞悬液加入侵袭小室上层，各组进行相应的实验，48 h后取出侵袭小室，棉签擦净侵袭小室上室面的人工基质胶和细胞，PBS漂洗5 min，重复3次，福尔马林固定30 min后，苏木素轻度染色，无水酒精脱水，环割取下侵袭小室膜，细胞面朝上浸于二甲苯中透明2 min，在载玻片上滴一滴中性树脂，取出侵袭膜，细胞面朝上置于树脂中，再滴一滴中性树脂，盖玻片封片。细胞侵袭力测定:200倍光镜下取上、下、左、右、中心5个视野，记录膜下室面的细胞数，取均数，平均细胞数代表细胞侵袭力。

1.6 裸鼠分组及皮下移植瘤模型 28只SPF级BALB/C雌性裸鼠购自第三军医大学动物实验中心，15～20 g重，5～7周龄，饲养于超净生物层流架内，定期紫外线消毒，灭菌处理水和饲料供动物自由摄入，动物房温度在23～25℃，湿度在40% ～60%，实验操作均在无菌罩内进行。取对数生长期T24细胞，用PBS制备成单细胞悬液，调整活细胞浓度为2×107/ml，每只裸鼠背部接种上述单细胞悬液0．2 ml，成瘤后将荷瘤裸鼠随机分4组，每组7只。蜂毒多肽低剂量组、中剂量组和高剂量组注入蜂毒多肽浓度分别为1 mg/kg、5 mg/kg和25 mg/kg，腹腔注射，1/d，连续治疗15 d，对照组注射等量生理盐水。

1.7 膀胱癌细胞裸鼠移植瘤体积测量、血液常规肝肾功能检测 每5天用游标卡尺测量一次裸鼠肿瘤最大长径(L)和最大横径(S)，肿瘤体积按0．5×L×S2计算，绘制肿瘤生长曲线，计算体积抑瘤率(抑瘤率=1－给药组体积/对照组体积)。第15天抽裸鼠尾静脉血测肝肾功能和血常规，血常规检测指标为白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)，肝功能检测指标为谷丙转氨酶(ALT)，肾功能检测指标为尿素氮(BUN)。

2 结果

2.1 蜂毒多肽对T24细胞生长的影响 随着蜂毒多肽浓度增加及作用时间延长，T24细胞生长受到明显抑制，具有时间效应和剂量效应，结果见表1、表2。

表1 蜂毒多肽对膀胱癌细胞增殖影响的吸光度检测(±s)

表1 蜂毒多肽对膀胱癌细胞增殖影响的吸光度检测(±s)

注:对照组为注射等量生理盐水;与对照组比较，a P＜0.05，b P＜0.01，与蜂毒多肽 1 mg/ml组比较，c P ＜0.05，d P＜0.01，与蜂毒多肽10 mg/ml组比较，f P＜0.01

组别 剂量(mg/ml)孔数12 h 24 h 48 h对照组 － 6 0．568 ±0．057 0．789 ±0．064 0．912 ±0．111蜂毒多肽组 1 6 0．512±0．044 0．714 ±0．061 0．847±0．105 10 6 0．422±0．034a 0．598 ±0．055bc 0．715±0．055bc 100 6 0．302±0．029bdf 0．425 ±0．066bdf 0．526±0．051 bdf

表2 蜂毒多肽对膀胱癌细胞抑制率(%)

2.2 蜂毒多肽对T24细胞周期和凋亡的影响 作用48 h时，随着蜂毒多肽浓度增加，膀胱癌细胞生长受到明显抑制，细胞阻滞于G0/G1期，细胞凋亡率显著升高，具有剂量效应。结果见表3。

2.3 细胞侵袭力测定结果 作用48 h时，随着蜂毒多肽浓度增加，细胞侵袭力显著下降，结果见表3。

表3 蜂毒多肽对膀胱癌细胞周期及凋亡率影响的检测(±s)

表3 蜂毒多肽对膀胱癌细胞周期及凋亡率影响的检测(±s)

注:对照组注射等量生理盐水;与对照组比较，b P＜0．01;与蜂毒多肽1 mg/ml组比较，d P＜0．01;与蜂毒多肽10 mg/ml组比较，f P ＜0．01

组别 剂量(mg/ml) 孔数 G0/G1(%) S(%) G2/M(%) 凋亡率(%) 细胞侵袭力(个/视野)对照组 － 6 46．2±4．6 34．2±3．3 18．2±2．1 4．2 ±0．3 162．4±13．5蜂毒多肽组 1 6 49．5 ±5．2 32．2 ±3．2 17．2 ±2．0 6．3 ±0．6b 101．4 ±10．5 10 6 62．7 ±5．2bd 23．7 ±2．7bd 14．9 ±1．5bd 11．2 ±2．3bd 68．5 ±7．9bd 100 6 79．2 ±6．9bdf 14．8 ±2．2bdf 11．1 ±1．2bdf 17．6 ±3．7bdf 25．4 ±2．7 bdf

2.4 蜂毒多肽对裸鼠的抑瘤效应 蜂毒多肽低剂量组、中剂量组和高剂量组的肿瘤体积呈降低趋势，具有药物作用剂量的效应和时间效应。结果见表4、5。

2.5 荷瘤裸鼠血常规及肝肾功能检测结果 蜂毒多肽组血常规及肝肾功能与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结果见表6。

表4 蜂毒多肽荷瘤裸鼠抑瘤率检测结果(%)

表5 荷瘤裸鼠肿瘤体积检测结果(mm3，±s)

表5 荷瘤裸鼠肿瘤体积检测结果(mm3，±s)

0 d 5 d 10 d 15 d对照组 － 7 143．1 ±12．4 369．7 ±30．1 555．4 ±44．1 600．7 ±5组别 剂量(mg/ml) 只数5．2蜂毒多肽低剂量组 1 7 144．7 ±12．5 344．7 ±29．8 494．7 ±42．1 552．9 ±46．8蜂毒多肽中剂量组 5 7 142．8 ±11．9 284．4 ±28．0bd 355．4 ±29．5bd 422．8 ±42．7bd蜂毒多肽高剂量组 25 7 140．1 ±12．5 214．4 ±22．2bdf 255．7 ±26．3bdf 303．6 ±27．4 bdf

注:对照组注射等量生理盐水;与对照组比较，bP＜0．01;与蜂毒多肽低剂量组比较，dP＜0．01;与蜂毒多肽中剂量组比较，fP ＜0．01

表6 荷瘤裸鼠血常规及肝肾功能指标比较(±s)

表6 荷瘤裸鼠血常规及肝肾功能指标比较(±s)

注:对照组注射等量生理盐水

组别 剂量(mg/ml) 只数 白细胞(×109/L)红细胞(×1012/L)血红蛋白(g/L)血小板(×109/L)谷丙转氨酶(U/L)尿素氮(μmol/L)对照组 － 7 5．10 ±1．14 6．68 ±0．35 139．20 ±13．81 428．66 ±111．28 98．80 ±42．58 13．20 ±3．68蜂毒多肽低剂量组 1 7 4．75 ±1．45 6．78 ±0．48 145．20 ±12．62 436．12 ±101．36 101．20 ±38．46 12．60 ±4．28蜂毒多肽中剂量组 5 7 4．78 ±1．34 6．56 ±0．52 142．20 ±13．83 426．68 ±110．62 97．60 ±44．82 13．82 ±4．18蜂毒多肽高剂量组 25 7 4．86 ±1．44 6．74 ±0．56 136．20 ±15．21 408．98±119．68 99．48 ±47．52 14．12 ±3．38

3 讨论

蜂毒是工蜂毒腺和附腺分泌出的一种具有芳香气味的透明毒液，在我国，传统中医以蜂毒入药治病有着悠久的历史。蜂毒的化学成分比较复杂，其主要活性物质是蜂毒多肽，主要由蜂毒肽、蜂毒明肽、含组胺肽、磷脂酶A2、透明质酸酶等成分组成，约占干蜂毒的50%［8］。现代药理研究表明它具有抗炎、镇痛、抑制血小板凝集、抗艾滋病及抗肿瘤等多种作用［9］。近年来蜂毒多肽所具有的抗肿瘤活性引起大量研究者的关注，研究认为蜂毒多肽能够溶解细胞线粒体膜，抑制细胞的正常呼吸，使肿瘤组织氧化与磷酸化的过程受到抑制，破坏其氧化功能，从而抑制肿瘤组织生长［10-11］。

本实验通过细胞培养和动物实验观察蜂毒多肽对膀胱癌T24细胞生长的影响，结果显示，随着蜂毒多肽浓度从1 mg/ml增加到100 mg/ml，作用时间从12 h到48 h，T24细胞的体外生长受到明显抑制，细胞生长抑制率显著升高，具有药物作用剂量效应和时间效应。蜂毒多肽组裸鼠移植瘤体积显著小于对照组，随蜂毒多肽浓度增加，肿瘤生长抑制率显著升高，表明蜂毒多肽可显著抑制膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长，证实了蜂毒多肽对肿瘤细胞在体内及体外均具有显著杀伤、抑制作用。

细胞的增殖与凋亡失衡是肿瘤形成和发展的重要机制，该过程涉及多个基因的改变，并受复杂的信号转导网络系统调节［12］。膀胱癌细胞生长是一个多基因参与、经历多步骤的复杂过程，这些基因功能涉及细胞增殖、分化和衰老及凋亡等基本生命过程的调控［13-14］，其中，细胞凋亡是受基因调控的一种主动性细胞自杀过程，它与肿瘤的发生、发展和消退有密切关系，具有独特的生化和形态特征［15］。膀胱癌细胞的发生不仅与细胞增殖失控有关，也与凋亡的减少有密切关系［16］。本研究显示随着蜂毒多肽浓度增加，膀胱癌细胞生长受到明显抑制，细胞阻滞于G0/G1期，细胞凋亡率显著升高，100 mg/ml蜂毒多肽作用48 h时，细胞凋亡率较高，说明蜂毒多肽体外可诱导T24膀胱癌细胞发生凋亡来产生抗肿瘤活性。根据本研究及多种体外实验推测蜂毒多肽很可能是通过影响G1期周期调节因子的活性而发挥周期调控作用的［17］。我们同时可以观察到，随着蜂毒多肽浓度增加，膀胱癌细胞侵袭力显著下降，具有药物作用剂量依赖性，表明蜂毒多肽可通过抗侵袭机制来抑制肿瘤生长和扩散。蜂毒多肽诱导肿瘤细胞凋亡的具体途径可能与细胞的类型、状态、信号途径中的各个效应器的活性及功能有关，有待进一步的研究。

蜂毒多肽在体内大剂量应用易产生溶血等副作用，而小剂量副作用虽减轻，但其抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡的效应也相应减弱［18-19］，这成为限制其临床应用的主要障碍之一，至今未见有用于治疗肿瘤的临床报道［20］。天然的蜂毒成分复杂，含有十余种生物活性肽，以及五十多种酶类物质，而蜂毒多肽的分子结构中有3个赖氨酸和2个精氨酸残基使其成为一种强碱性肽［21］。其溶血副作用主要是通过裂解细胞膜完成的，深入研究其构效关系，通过结构改造不但可减低溶血等副作用，还可使抗肿瘤作用大大加强［22-23］。有研究认为在体外及动物实验中未发现蜂毒多肽的溶血及细胞毒等副作用，可能与药物主要作用于肿瘤细胞及分布在肿瘤组织，全身浓度较低有关［24］。因此，蜂毒多肽通过结构改造的新型制剂的应用既避免了体内溶血及细胞毒等副作用，又可抑制肿瘤生长，为蜂毒多肽在临床的剂量确定及作用机制提供了依据［19］。

蜂毒多肽对体外多种实验性肿瘤具有杀伤作用，在治疗恶性肿瘤方面有一定的临床应用前景，关于蜂毒多肽及其新剂型的抗肿瘤作用机制及最佳作用浓度有待进一步的深入研究，当然其潜在的细胞毒副作用亦不容忽视，使蜂毒多肽成为一种低毒有效的新型抗癌药物应用于临床是下一步研究的重点。

［1］ Müller W D，Fahlbusch B，Jung K，et al．Characterization of murine monoclonal antibodies to phospholipase A2 and mellitin from bee venom［J］．Int Arch Allergy Immunol，1993，101(2):153-158．

［2］ Lee W R，Kim SJ，Park JH，et al．Bee venom reduces atherosclerotic lesion formation via anti-inflammatory mechanism［J］．Am J Chin Med，2010，38(6):1077-1092．

［3］ Guha N，Steenland NK，Merletti F，et al．Bladder cancer risk in painters:a meta-analysis［J］．Occup Environ Med，2010，67(8):568-573．

［4］ 米华．性激素及其受体与膀胱癌［J］．临床荟萃，2000，15(11):525-526．

［5］ 王荣江，赵红星，邵四海，等．经尿道膀胱肿瘤切除术联合髂内动脉栓塞化疗治疗膀胱癌［J］．中国医药，2007，2(2):101-103．

［6］ 马素兰，张玉书，赵宏，等．39例表浅膀胱癌经尿道切除术后放疗的临床疗效观察［J］．首都医科大学学报，1997，18(2):157-159．

［7］ Shariat SF，Chade D C，Karakiewicz PI，et al．Update on intravesical agents for non-muscle-invasive bladder cancer［J］．Immunotherapy，2010，2(3):381-392．

［8］ Oren Z，Shai Y．Selective lysis of bacteria but not mammalian cells by diasteromers of melittin:structure-function study［J］．Biochemistry，1997，36(7):1826-1835．

［9］ 李玉梅，陈永强，顾伟．蜂毒及其主要成分蜂毒素抗肿瘤机制研究进展［J］．中国中医药信息杂志，2008，15(1):96-97．

［10］ Yang E J，Jiang JH，Lee SM，et al．Bee venom attenuates neuroinflammatory events and extends survival in amyotrophic lateral sclerosis models［J］．J Neuroinflammation，2010，15(7):69．

［11］ Chen H S，Qu F，He X，et al．The anti-nociceptive effect and the possible mechanism of acupoint stimulation caused by chemical irritants in the bee venom pain model［J］．Brain Res，2010，1355:61-69．

［12］王怡苹，吕雄文，赵斌，等．蜂毒素对胃癌细胞系SGC-7901细胞增殖抑制作用及机制［J］．安徽医科大学学报，2010，54(4):503-508．

［13］ Volanis D，Kadiyska T，Galanis A，et al．Environmental factors and genetic susceptibility promote urinary bladder cancer［J］．Toxicol Lett，2010，193(2):131-137．

［14］Margulis V，Lotan Y，Shariat SF．Survivin:a promising biomarker for detection and prognosis of bladder cancer［J］．World JUrol，2008，26(1):59-65．

［15］丁波泥，陈道瑾，李小荣，等．天花粉蛋白抑制乳腺癌生长的实验研究［J］．实用肿瘤杂志，2008，23(4):310-313．

［16］侯毅，张平，董自强，等．蜂毒素对人膀胱癌T24细胞体外增殖的抑制作用［J］．广东医学，2012，33(13):1889-1891．

［17］于明哲，李俊，黄成，等．蜂毒素对人胚肺成纤维细胞生长的抑制作用及其机制探讨［J］．中国药理学通报，2013，29(7):918-922．

［18］苏永华，张建国，张慧卿，等．蜂毒素磁性纳米制剂对肝癌荷瘤鼠的治疗作用及其机制［J］．中华实验外科杂志，2009，26(7):938．

［19］高启龙，李玉梅，陈永强，等．蜂毒素对骨肉瘤UMR-106细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响［J］．中华中医药学刊，2008，26(3):522-524．

［20］王傅喆，李柏．降低蜂毒素溶血作用的研究进展［J］．北方药学，2012，9(5):39-40．

［21］侯春生，郭丽琼，王建荣，等．蜂毒溶血肽及蜂毒主要功能成分研究进展［J］．中国生化药物杂志，2012，33(5):682-685．

［22］赵亚华，李日清，张微，等．蜂毒肽的溶血作用与红细胞膜上两种酶活性变化的关系［J］．中国生物化学与分子生物学报，2008，24(6):522-530．

［23］马倩，檀英霞，王颖丽，等．穿膜肽AR-23增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率及其机制的初步研究［J］．军事医学，2013，37(5):349-353．

［24］黄舒然，邹玺，周锦勇，等．蜂毒素对胃癌细胞株BGC-823生物行为学的影响［J］．时珍国医国药，2013，24(5):1068-1070．