SBEM基因在三阴乳腺癌细胞中的表达及抗原表位的筛选

刘兆喆，郝 辉，郭 放，韩 涛，韩雅玲，谢晓冬

远处转移几乎是所有乳腺癌患者的死亡原因，肿瘤细胞在转移灶的停留和生长都是引起继发性远处转移的必要步骤［1］。在临床上将这些常规病理学和影像学检查不能发现的肿瘤细胞播散定义为微转移，早期检测出微转移并对其进行临床干预是改善患者预后的重要方法。有研究表明，乳腺上皮粘蛋白(SBEM)基因可能作为特异性的分子标记物来检测乳腺癌患者骨髓中肿瘤播散细胞，并可作为监测骨髓微转移变化情况的重要指标［2-3］，且其在三阴乳腺癌患者中表达较高，有望成为三阴乳腺癌患者预后的预测分子［4］。本研究拟在细胞水平对SBEM基因的表达情况进行研究，并进一步筛选出蛋白的保护性抗原表位，为乳腺癌免疫治疗提供理想的干预靶点，进而指导基因疫苗的设计。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞株MDA-MB-231(购自中科院上海细胞研究所)。

1.2 主要试剂、仪器 即用型免疫组织化学超敏UltraTMSP试剂盒(北京中杉金桥公司)，流式细胞仪B0091(美国BD公司)，总RNA提取液TRIZOL、DNA Mark及Premix Taq(大连宝生物公司，中国)，RT-PCR试剂盒(TransGen Biotech公司，中国)，低温离心机(Thermo)，PCR仪(美国PE公司)、凝胶电泳及成像系统(美国UVP公司)。引物由大连宝生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:在37℃，5%CO2的条件下培养，细胞单层贴壁生长，待长至80% ～90%细胞发生融合时，弃去培养液。用1 ml 0．25%胰酶EDTA溶液消化，收集细胞，进行细胞计数，并传代培养。

1.3.2 反转录聚合酶链反应(RT-PCR):应用TRIZOL法提取总RNA。取适量RNA溶液，紫外分光光度定量，按1 OD(260 nm)=40μg的标准，A260/A280的比值为1．8～2．1。应用RT-PCR试剂盒进行反转录及PCR反应。SBEM和GAPDH mRNA的反应条件:预变性 94℃、5 min，35个循环;94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s;延伸 72℃、8 min。

1.3.3 免疫细胞化学法:收集细胞，获得约1×105/100μl细胞悬液，取50～100μl接种至96孔板。次日，观察细胞贴壁情况，PBS洗涤3次;加入50μl、95%乙醇，室温固定 10 min;弃上清，PBS洗涤3次，加入50μl过氧化酶阻断液(试剂A)，室温孵育10 min，PBS洗涤3次，加入一滴非免疫的动物血清(试剂B)，室温孵育10 min;弃去血清，加入50μl SBEM抗体(1∶50)，4℃过夜;PBS洗涤3次，加入50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温孵育10 min，PBS洗涤3次，加入50μl链霉素抗生素－过氧化物酶溶液(试剂D)，室温孵育10 min;PBS洗涤3次，加入100μl新鲜配制的DAB溶液，染色1～3 min;PBS洗涤1次，显微镜下拍照。

1.3.4 流式细胞术:收集细胞，密度为5×105/100μl，取200μl细胞悬液加入标记好的流式管中，4℃，1400 rpm离心 5 min;弃上清，加入 100μl SBEM一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜;次日，4℃，1400 rpm离心5 min，PBS洗涤2次;加入100μl FITC标记的羊抗兔二抗(1∶100)，4℃避光孵育30 min;阴性对照组未加SBEM一抗，仅加入二抗;PBS洗涤2次，加入400μl PBS液重悬细胞，上机进行检测。

1.3.5 电泳分析:PCR扩增产物由EB替代染色，电泳条件:2%琼脂糖凝胶，0．5×TBE，恒压100 V，约30 min。在凝胶电泳成像系统下观察并拍照。

1.4 表位预测 通过生物信息学的方法，结合SYFPEITHI和ProPred-I表位预测数据库，应用多种参数进行分析，预测SBEM蛋白的白细胞抗原(HLA)-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS 13．0统计软件进行处理，计量资料结果以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 SBEM mRNA在MDA-MB-231细胞中呈高表达，见图1。Quantity One凝胶分析软件计算 SBEM/GAPDH(光密度比值)为(2．25±0.22)%。

图1 乳腺上皮粘蛋白mRNA在MDA-MB-231细胞中的表达

2.2 免疫细胞化学染色结果 免疫细胞化学结果显示，SBEM蛋白在MDA-MB-231细胞膜上呈高表达，见图2。

图2 乳腺上皮粘蛋白在MDA-MB-231细胞中的表达(DAB×400)

2.3 流式细胞术结果 流式细胞术检测SBEM蛋白在 MDA-MB-231细胞上的表达率为(76．3±6.6)%;阴性对照组表达率为(2．6±1．1)%，差异具有统计学意义(P＜0．05)，见图3。

图3 乳腺上皮粘蛋白在MDA-MB-231细胞的表达

2.4 SBEM蛋白的氨基酸序列 通过NCBI网站获得SBEM蛋白的 GenBank登录号，为 Accession:EAW96795．1 GI:119617201。SBEM蛋白含有90个氨基酸，具体如下:mkflavlvllgvsiflvsaqnpttaapadtypatgpaddeapdaettaaattattaapttattaasttarkdipvlpkwvgdlp ngrvcp。

2.5 SYFPEITHI法预测HLA-A*0201限制性CTL表位结果 通过SYFPEITHI预测法，得到HLA-A*0201限制性CTL表位结果见表1(仅将得分≥18的9肽序列列出)，其中分值＞20的9肽共5条，分值由高到低分别为 9-17，8-16，75-83，6-14，4-12。

表1 SBEM蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位(9肽)

2.6 ProPred-I预测法结果 通过ProPred-I法，得到HLA-A*0201限制性CTL表位结果如表2，其中分值＞20的9肽共2条，分值由高到低分别为9-17，8-16。

表2 ProPred-Ⅰ法得到HLA-A*0201限制性CTL表位(9肽)

3 讨论

SBEM是2002年5月Richard等［5］利用公共序列标签表达的同位素标记技术和基因表达系列分析数据库首次报道的一种基因。其表达具有特异性，仅在乳腺和唾液腺中表达，与MUC-1相比具有高度特异性，是有望用于乳腺癌微转移检测的分子标志物。

有研究表明，SBEM蛋白表达与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移相关［6-8］。乳腺癌患者外周血中SBEM mRNA表达阳性率为55．96%(61/109)，与TNM分期和淋巴结转移相关。SBEM mRNA表达与激素受体和CerbB-2之间虽然没有相关性，但在ER/PR(－)患者中SBEM的表达较ER/PR(+)的患者高，表明SBEM基因与不良预后因素之间存在关联，可作为独立的分子标记物筛查出部分具有高复发转移风险的乳腺癌患者［9］。此外，应用荧光定量PCR技术监测新辅助化疗前后SBEM基因表达水平的变化，发现在3周期化疗后，58%乳腺癌患者SBEM基因的表达水平有所下调，提示SBEM基因有望成为预测新辅助化疗疗效的分子标记物［9］。但到目前为止，鲜有研究者在细胞水平上对SBEM蛋白进行研究，而且该蛋白在乳腺癌免疫治疗中的研究尚未见报道。

本研究选取 ER(－)、PR(－)、HER-2(－)的MDA-MB-231乳腺癌细胞系作为对象，应用免疫细胞化学、流式细胞术和RT-PCR 3种实验方法，分别检测SBEM蛋白和基因在细胞中的表达情况。结果发现SBEM mRNA和蛋白在MDA-MB-231细胞中呈高表达，提示其表达水平与乳腺癌细胞的病理类型相关。研究显示，有淋巴结转移的乳腺癌患者血清中SBEM含量明显高于无淋巴结转移者，Ⅲ+Ⅳ期患者亦显著高于Ⅰ+Ⅱ期，差异有统计学意义(P＜0．05)，SBEM高表达的患者发生转移的可能性较大［6］。本研究从乳腺癌细胞水平上验证了SBEM高表达与乳腺癌恶性程度有相关性，为后续进一步筛选SBEM蛋白的保护性抗原表位肽奠定了重要的实验基础。

抗原表位又称抗原决定簇，是指抗原分子上能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够被其识别的一个免疫活性区。免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质分子，而仅识别抗原肽分子上的表位［10］。按与抗原受体结合细胞的不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。抗原表位的研究对多肽和新型基因疫苗的设计研发具有重要意义。目前，常用的免疫信息学方法包括基于基序法的WAPPP、基于人工神经网络法的PAProc等［11-12］。采用免疫信息学预测方法，不但可以提高发现新表位的效率，而且能减少实验室工作量，节约大量研究经费。SBEM蛋白是MUC家族成员，仅有90个氨基酸序列，在乳腺癌细胞膜上呈高表达，可能通过掩盖肿瘤细胞抗原引起免疫逃避，故对其保护性抗原表位进行筛选，可为确定候选肽段和重组核酸疫苗提供重要的实验基础。在我国人群的HLA-Ⅰ类抗原中，A2抗原频率高达53%，因此寻找SBEM抗原HLA-A2限制性CTL表位具有重要的现实意义［13］。

本研究运用MHC配体和抗原表位肽数据库SYFPEITHI预测，将分值较高的抗原肽再基于结构的表位预测算法MHCpred 2．0进行结构亲和性分析。把初选的九肽通过蛋白酶体裂解基序NETChop 3．0 server酶切分析。最终筛选出两条最具有亲和力的九肽:LLGVSIFLV(9-17)和VLLGVSIFL(8-16)。通过生物信息学方法预测抗原表位，有助于基因疫苗的研制及抗体药物的研制和开发。总之，本研究在细胞水平对SBEM基因的表达进行研究，并筛选出乳腺癌高表达SBEM抗原表位，为个体化治疗乳腺癌转移提供理想的干预靶点及新思路。

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