Gardiquimod对HepG2细胞中VEGF和TIMP1表达的影响

程丰伟，李 磊，王 芳，金 锐，罗 欣，张胜权

◇基础医学研究◇

Gardiquimod对HepG2细胞中VEGF和TIMP1表达的影响

程丰伟，李 磊，王 芳，金 锐，罗 欣，张胜权

目的研究Toll样受体7（TLR7）的配体Gardiquimod 对HepG2细胞中血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）mRNA表达的影响，并分析其激活的信号通路。方法HepG2细胞经不同时间的Gardiquimod（2 μg／ml）处理后，提取细胞总RNA和总蛋白，RT-PCR分析VEGF和TIMP1转录水平的变化；Western blot分析丝裂原蛋白激活激酶－胞外信号调节激酶（MAPKs-ERK1／2）信号通路，并通过MAPKs-ERK1／2特异性阻断剂PD98059阻断相应的信号途径，进而分析两者的相关性。结果HepG2细胞中表达TLR7，但较外周血单个核细胞（PBMC）较少。Gardiquimod刺激HepG2 10 min后下调细胞中VEGF mRNA的表达，而刺激细胞30 min后TIMP1 mRNA的表达有明显的上调；Western blot结果显示，细胞中的ERK1／2的磷酸化水平明显降低；并且ERK1／2的特异性抑制剂（PD98059）能有效抑制HepG2细胞中ERK1／2磷酸化作用。结论TLR7激活能够下调HepG2细胞中VEGF的表达，并与ERK1／2信号通路相关；同时TLR7激活上调TIMP1的表达，但与ERK1／2信号通路无相关性。

TLR7；VEGF；TIMP1；HepG2；Gardiquimod

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类重要模式识别受体（patternrecognition receptors，PRR），不仅参与先天性免疫，而且在获得性免疫中也发挥重要作用。TLR7能识别某些天然小分子抗病毒化合物和病毒单链RNA（single-stranded RNA，ssRNA），激活髓系分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖的信号通路，介导抗病毒免疫反应［1］。并且，TLR7亦可识别一些人工合成的咪唑喹啉类或鸟苷酸衍生物类的小分子化合物，如R848和Gardiquimod等。近年来研究［2］显示TLR7不仅仅表达于免疫细胞，而且在部分癌细胞中也有表达，特别在血液肿瘤以及皮肤肿瘤中关于TLR7的研究常见报道，具体作用尚不明确，但TLR7与肿瘤的发生、迁移等密切相关。研究［3］显示TLR7激活后具有促某些抗肿瘤的细胞因子表达，并对某些肿瘤的侵袭、转移有一定抑制作用。临床上将TLR7激动剂咪喹莫特作为治疗血液系统肿瘤的方法，明显减轻了慢性淋巴细胞白血病患者肿瘤的皮肤浸润；TLR7配体咪喹莫特作用于原发性皮肤肿瘤后能激活核因子κB（NF-κB）信号途径并且诱导促炎症因子以及相关细胞因子的表达［4］。但TLR7对肝癌细胞中一些相关炎症因子表达的影响尚不清楚，该研究以HepG2细胞为模式细胞，观察TLR7激活后细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基质金属蛋白酶抑制剂1 （matrix metallo-proteinase inhibitor 1，TIMP1）表达的变化，并分析其相关的信号途径。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂HepG2细胞株由本实验室冻存；外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）细胞提取于新鲜血液。Gardiquimod、PD98059购于美国Sigma公司；TLR7及β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；ERK1／2及p-ERK1／2抗体购于美国Cell signaling公司；RT-PCR试剂购于日本TaKaRa公司；逆转录试剂购于加拿大Fermentas公司；新生小牛血清、DMEM培养基购于美国Gibco公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 引物登陆NCBI网站检索GAPDH、VEGF、TIMP1基因序列（Human），Primer Premier 5.0软件设计3对引物，见表1。

1.3 细胞培养将冻存的HepG2细胞复苏并接种于25 ml的培养瓶中，加入5 ml含10%小牛血清并加入双抗（青霉素与链霉素）的DMEM培养液，置5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。细胞传代2～3次后，状态较佳时，使用胰酶消化细胞并将之接种于24孔细胞培养板，浓度约为5×104／孔；待细胞全部贴壁后换无血清的DMEM培养并加入Gardiquimod （2 μg／ml）刺激，时间分别为10、30 min，1、3、6、12、24、36 h，并设置空白对照。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.4 RT-PCR分析VEGF mRNA和TIMP1 mRNA水平的变化提取24孔细胞板中加药刺激后细胞的总RNA，逆转录PCR（步骤遵循试剂盒说明书）合成cDNA模板以备下步使用。配制RT-PCR体系如下：每份加入SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，Rox Reference DyeⅡ（50×）0.4 μl，上一步保存的cDNA模板2 μl，ddH2O 6.8 μl，总共20 μl体系，以GAPDH为内参，上机（7500型荧光定量PCR仪）检测。

1.5 Western blot分析提取24孔细胞板中加药刺激后细胞总蛋白，－20℃储存备用。配制10% SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样10 μl，设置60 V电压进行Tris甘氨酸电泳缓冲液电泳，至溴酚蓝超出分离胶后将电压调至120 V，待溴酚蓝泳至凝胶底部，结束电泳。设置150 mA，湿转法将蛋白质冰上转移至PVDF膜上，时间为3 h。将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，置于相应的一抗中，4℃结合过夜，取出PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min，置于相应的二抗中室温结合2 h；TBST洗膜3次，加入ECL发光剂，显影压片。抗体浓度如下，抗β-actin：一抗1∶5 000，二抗1∶5 000；抗p-ERK：一抗1∶1 000，二抗1∶10 000；抗TLR7：一抗1∶500，二抗1∶5 000。

1.6 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以±s表示，不同时间点之间的比较采用方差分析，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 TLR7在HepG2细胞的表达提取HepG2细胞的总蛋白，Western blot检测细胞中TLR7蛋白的表达，设置PBMC作为对照组。结果显示TLR7在HepG2细胞中表达，但表达量较PBMC略少，见图1。

图1 Western blot分析TLR7蛋白在HepG2细胞以及PBMC中的表达

2.2 不同时间的Gardiquimod对HepG2细胞VEGF和TIMP1的mRNA表达的影响TLR7配体Gardiquimod刺激HepG2细胞后RT-PCR分析VEGF mRNA和TIMP1 mRNA表达水平的变化。检测结果显示，TIMP1 mRNA水平在36 h内较空白对照组明显上调，并且在6 h达到峰值；VEGF mRNA水平在36 h内较空白组显著降低，在6 h表达水平又有一个短暂的回升，并在1 h时降至最低，见图2。

图2 Gardiquimod（2μg／ml）对HepG2细胞中VEGF、TIMP1 mRNA表达量的影响

2.3 Western blotp-ERK1／2的表达量较空白组显著降低，6 h内呈时间依赖性，并在6 h表达最弱，见图3。

图3 Western blot分析p-ERK1／2蛋白表达

2.4 Gardiquimod与PD98059协同刺激HepG2细胞后对细胞中VEGF mRNA和TIMP1 mRNA表达的影响RT-PCR检测显示：①PD98059刺激HepG2细胞后，细胞中VEGF mRNA的表达量较空白对照组有下降的趋势，见图4，而Gardiquimod刺激细胞后也下调VEGF mRNA的表达量（图2），并且磷酸化的ERK1／2的表达量有明显的下调趋势（图3），由此推断，Gardiquimod刺激细胞的过程可能与ERK1／2信号途径相关。②PD98059下调TIMP1 mRNA的表达（图4），但是Gardiquimod刺激细胞后下调ERK1／2的磷酸化并上调TIMP1 mRNA的表达（图2、3），提示Gardiquimod上调TIMP1的表达与ERK1／2信号途径可能无相关性。

图4 PD98059和Gardiquimod协同刺激后HepG2细胞中VEGF mRNA和TIMP1 mRNA的相对表达量

2.5 特异性抑制剂对细胞中信号通路的影响Western blot检测结果表明，p-ERK1／2的特异性抑制剂PD98059（100 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞中ERK1／2磷酸化作用，见图5。

图5 特异性抑制剂对HepG2细胞中ERK1／2磷酸化的影响

3 讨论

近年来研究［5］表明肝癌细胞中高表达VEGF，后者在肿瘤组织中促进血管生成，对于肿瘤细胞的增殖、迁移均不可或缺。基质金属蛋白酶家族（MMPs）及基质金属蛋白酶抑制剂家族（TIMPs）作为一对相辅相成的细胞因子，与肿瘤增殖、侵袭和迁移密不可分［6］。细胞外基质（ECM）是肿瘤侵袭和转移的重要组织屏障，MMPs则是突破这个屏障最有效的裂解酶。TIMPs家族在ECM中可以抑制MMPs的活性，主要方式是通过与MMPs结合成紧密的非共价键复合物，从而调节MMPs的表达［7－8］。丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）是真核生物信号传递中最重要的途径之一，MAPK接收胞外信号后活化，进入细胞核中激活相应的靶基因，参与基因表达调控、细胞质功能活动等。MAPK可促进血管内皮细胞的增殖以及新血管生成，是肿瘤发生和转移中的重要因素［9］。ERK1／2是MAPK 4个最主要的亚族之一。有研究［10－11］表明ERK1／2在肝癌以及前列腺癌等多种肿瘤组织中均出现活性增强或者表达异常，而且，有研究［12］表明ERK1／2抑制剂可以将乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤等肿瘤细胞阻断在S期，抑制肿瘤细胞增殖和生长；胃癌组织中ERK1／2和VEGF表达呈正相关，两者在胃癌的发生、发展中共同促进了肿瘤的浸润和转移［13］。因此，ERK1／2表达调控异常与肿瘤的发生有着密切关系。

本研究提示2 μg／ml的Garquimod刺激HepG2细胞VEGF mRNA水平显著下降，并在1 h时达到最低；并且细胞中TIMP1 mRNA水平显著上升，并在6 h时达到峰值。磷酸化ERK1／2的表达量呈逐渐下降的趋势，一定周期内具有时间依赖性，在6 h时达到最低。以上结果提示TLR7激活可能对HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭有着一定程度的抑制作用；抑制剂研究结果提示，Gardiquimod下调细胞中VEGF的表达可能与ERK1／2的磷酸化相关，下调p-ERK可能是Gardiquimod抑制HepG2细胞VEGF表达的一个重要途径。Gurdquimod上调TIMP1的表达这一效应具体是通过哪些信号途径，有待进一步研究。并且，Gardiquimod对HepG2细胞的凋亡、迁移是否能发挥一定的生物学作用，还有待进一步的探讨。

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Effects of Garquimod on the expression of VEGF and TIMP1 in HepG2 cells

Cheng Fengwei，Li Lei，Wang Fang，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of Toll-like receptor 7（TLR7）ligand Gardiquimod on vascular endothelial growth factor（VEGF）mRNA and matrix metallo-proteinase inhibitor 1（TIMP1）mRNA in HepG2 cells，and to analyze their activiated signal transduction pathways.MethodsExtracted total RNA and total protein of cultured HepG2 cells，which were treated with Gardiquimod（2 μg／ml）for different time.The mRNA expression of VEGF and TIMP1 was measured by Real-time PCR，and analyzed the ERK1／2 signal transduction pathway by using Western blot.And to use the specific inhibitor of ERK1／2（PD98059）to block corresponding signaling pathways，then the correlation was analyzed.ResultsTLR7 was expressed in HepG2 cells，but less than that in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）.After the HepG2 cells were treated with Gardiquimod for 10 min，the mRNA of VEGF in the cells was obviously reduced.However，when the cells were treated with Gardiquimod for 30 min，the mRNA of TIMP1 in HepG2 cells was obviously increased.Western blot results indicated that the phosphorylation of ERK1／2 in the cells was obviously downregulated.What’s more，the specific inhibitor of ERK1／2 （PD98059）could effectively suppress the phosphorylation of ERK1／2 in HepG2 cells.ConclusionTLR7 activation downregulates the expression of VEGF in HepG2 cells，and associates with ERK1／2 signal pathway；TLR7 activation raises the expression of TIMP1 at the same time，which is not related with ERK1／2 signal pathway.

TLR7；VEGF；TIMP1；HepG2；Gardiquimod

R 34

A

1000－1492（2014）05－0561－04

2014－01－05接收

国家自然科学基金（编号：81271748）

安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，合肥230032

程丰伟，男，硕士研究生；

张胜权，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：sqz36＠yahoo.com