骨髓间充质干细胞对大鼠肺气肿模型治疗机制的探讨

王丽雁，吴 倩，王叶芳，汪伟民

骨髓间充质干细胞对大鼠肺气肿模型治疗机制的探讨

王丽雁，吴 倩，王叶芳，汪伟民

目的通过研究骨髓间充质干细胞（BMSC）对大鼠肺气肿模型血清和肺泡灌洗液（BALF）中白介素-17（IL-17）、白介素-6（IL-6）的影响以及肺组织病理学变化，探讨BMSC对慢性阻塞性肺疾病（COPD）的干预机制。方法30只健康雄性SD大鼠，随机分成3组：正常对照组、肺气肿模型组、BMSC治疗组。通过气管内注射猪胰蛋白酶诱导建立肺气肿模型后，经大鼠尾静脉注射BMSC进行治疗。两周后处死大鼠，观察肺组织病理学变化及血清和BALF中白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比。使用ELISA方法检测血清和BALF中IL-17、IL-6水平。结果与正常对照组相比，肺气肿模型组和BMSC治疗组BALF中白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞的百分比升高（P＜0.05），BMSC治疗组较肺气肿模型组显著降低（P＜0.05）；ELISA法结果显示肺气肿模型组和BMSC治疗组血清和BALF中IL-17、IL-6水平较正常对照组显著升高，BMSC治疗组明显低于肺气肿模型组（P＜0.05）；病理观察肺气肿模型组和BMSC治疗组都可看到气肿样改变，BMSC治疗组与肺气肿模型组比较肺组织平均内衬间隔（MLI）降低，单位面积平均肺泡数（MAN）增加（P＜0.05）。结论BMSC可能通过调节炎细胞的增殖及趋化来干预IL-17、IL-6表达，以及促进受损肺组织的修复，来发挥对COPD的干预作用。

慢性阻塞性肺疾病；骨髓间充质干细胞；白介素-17；白介素-6

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的发病与气道慢性炎症及自身免疫异常有关，患者体内及气道局部存在大量炎细胞和炎性介质，如白介素（interleukin，IL）-17、IL-6。IL-17诱导多种趋化因子的分泌，引起气道和肺组织的损伤。IL-6促进中性粒细胞氧化和诱导淋巴细胞分泌抗体，延迟炎细胞凋亡，加重气道炎症反应。研究［1］表明，骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）可以通过全骨髓贴壁法获得，且经此方法获得的细胞稳定性和活力佳，分化潜能与安全性良好。该实验通过将BMSC经尾静脉注入大鼠肺气肿模型体内，观察BMSC对肺气肿模型肺组织的修复以及对炎症因子IL-17、IL-6的调节作用，初步探讨BMSC对COPD的干预机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂SPF级健康雄性SD大鼠33只，含3只体重80～100 g的幼鼠，余大鼠体重180～220 g，由安徽医科大学实验动物中心提供；猪胰蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）购自美国罗氏公司；胰酶、胎牛血清、L-DMEM培养基购自美国HyClone公司；大鼠IL-6、IL-17酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自美国R＆D公司。

1.2 BMSC的采集、分离与培养选择3只4周体重80～100 g的雄性SD大鼠，脱臼处死后，75%乙醇溶液浸泡10 min后，于超净工作台无菌分离双侧股骨，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用DMEM液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓。将获得的骨髓细胞悬浮液移入离心管，2 000 r／min离心10 min，弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养液（10%FBS，100 U／ml青霉素，100 U／ml链霉素）重悬，接种于25 cm2的塑料培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。48 h半量换液一次，去除未贴壁细胞，倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态特征。以后每3 d换液一次。当细胞铺满瓶底约80%时，用0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，待细胞形态由梭形变为圆形后，停止消化，按1∶2传代培养。

1.3 大鼠肺气肿模型的制备、实验分组及处理30只雄性健康SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为3组：正常对照组、肺气肿模型组、BMSC治疗组，每组各10只。将肺气肿模型组和BMSC治疗组大鼠分别称体重后，用体积分数为10%的水合氯醛（300 mg／kg）腹腔内注射麻醉后，将大鼠固定于操作台上，常规消毒，纵向切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及胸骨舌骨肌，暴露气管，4号针头刺入气管内一次性滴入配制的PPE生理盐水溶液1 U／g，并注入少量空气保证试剂或生理盐水全部进入气管，缝合皮肤，切口消毒，然后直立旋转大鼠，并按摩双侧胸部，使试剂均匀分布于双侧肺。正常对照组依同样方法注入等体重比量的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）。将鼠放入独立盒中，注意保温，等清醒后放入原盒中，以普通饲料喂养12周后。待大鼠肺气肿模型成功后，BMSC治疗组大鼠经尾静脉注入浓度为1×106个／ml的第3代BMSC 1 ml，正常对照组及肺气肿模型组给予等量PBS处理，各组继续饲养2周后处死所有大鼠。

1.4 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）细胞计数及IL-17、IL-6水平检测大鼠称重、腹腔麻醉后固定，无菌条件腹主动脉取血，标本室温下静止2 h后，3 000 r／min离心5 min，收集血清，分装储存于－80℃备用。暴露气管和肺门，于右主支管处结扎右肺，生理盐水2 ml×3次行左肺肺泡灌洗，回收的BALF存入硅塑管内，以1 500 r／min离心10 min，取上清液冻存－80℃备用。同时收集细胞并计算中性粒细胞和淋巴细胞百分率。按ELISA试剂盒说明书检测血清和BALF中IL-17、IL-6的浓度。

1.5 肺组织标本的留取肺泡灌洗完毕后弃左肺，切取右侧肺组织，置于4℃PBS中洗去血液。所有大鼠取右肺组织浸入10%福尔马林液中固定24 h，制备蜡块。

1.6 肺组织病理学观察各组大鼠肺组织切片行HE染色作常规病理学检查。每例标本选2张切片，每切片随机取上、下、左、右、中5个视野，测量时尽量避开支气管及大、中血管。观察肺平均内衬间隔（mean linear intercept，MLI）和单位面积平均肺泡数（mean alveolar numbers，MAN）。每只大鼠检测10个区域。

1.7 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件分析，数据以±s表示，组间比较采用方差分析及SNK检验。

2 结果

2.1 BMSC的培养原代培养24 h后，可见少量贴壁细胞，细胞大小及形态不均一，呈圆形或内皮细胞样；培养48 h半量换液，去除未贴壁的细胞，此时细胞开始融合，在集落中心密集，且集落间出现重叠，见图1A；约7 d细胞融合达80%以上，传代后细胞呈均匀分布的长梭形生长，平行或螺旋状排列，见图1B。本实验通过全骨髓贴壁法获得BMSC。

图1 体外培养BMSC的形态学观察 ×200

2.2 血清和BALF细胞计数肺气肿模型组、BMSC治疗组血清和BALF中白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比显著高于正常对照组（P＜0.01）。BMSC治疗组大鼠BALF中白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比均低于肺气肺模型组（P＜0.05），见表1。

2.3 血清及BALF中IL-17、IL-6水平ELISA结果显示：肺气肿模型组与正常对照组比较，BALF和血清中IL-17、IL-6水平均明显升高（P＜0.01）；且BMSC治疗组与肺气肿模型组比较，BALF中IL-17、IL-6水平均下降（P＜0.05），见表2。

表1 3组大鼠BALF中细胞计数及分类（n＝10，±s）

表1 3组大鼠BALF中细胞计数及分类（n＝10，±s）

与正常对照组比较：**P＜0.01；与肺气肿模型组比较：ΔP＜0.05

组别白细胞总数（×109／L）中性粒细胞百分比（%）淋巴细胞百分比（%）正常对照2.41±0.687.96±3.76.42±1.45肺气肿模型5.33±0.57**24.01±4.91**12.50±2.39**BMSC治疗3.73±0.77Δ15.32±2.27Δ8.23±1.54Δ

表2 3组大鼠BALF和血清中的IL-17和IL-6水平（ng／L，n＝10，±s）

表2 3组大鼠BALF和血清中的IL-17和IL-6水平（ng／L，n＝10，±s）

与正常对照组比较：**P＜0.01；与肺气肿模型组比较：ΔP＜0.05

组别血清BALF IL-17IL-6 IL-17IL-6正常对照41.31±3.1211.64±0.8954.61±4.1215.89±1.52肺气肿模型60.50±5.24**23.22±1.42**72.42±4.48**32.12±2.23**BMSC治疗50.60±3.62Δ17.24±3.04Δ60.83±3.76Δ24.14±3.42Δ

2.4 大鼠肺组织病理学结果正常对照组大鼠肺组织肉眼观表面光滑淡红色，质地较软，且富有弹性，指压无痕，镜下见肺组织均匀一致。肺气肿模型组大鼠肺脏肉眼见肺组织体积增大表面有囊泡状突起，色泽苍白，质地较硬且弹性差，指压后见压痕，切面可见肺组织形态大小不均一。HE染色结果显示：除正常对照组以外，肺气肿模型组和BMSC治疗组的肺组织均出现肺泡壁不同程度的变薄，部分断裂，肺泡腔扩大。BMSC治疗组较肺气肿模型组肺气肿明显减轻，见图2。单位面积内，肺气肿模型组和BMSC治疗组的MAN小于正常对照组，而MLI大于正常对照组（P＜0.05）；BMSC治疗组与肺气肿模型组相比，MAN大于肺气肿模型组，MLI小于肺气肿模型组（P＜0.05），见表3。

图2 大鼠肺组织病理学结果×200

表3 3组大鼠肺组织病理学比较（n＝10，±s）

表3 3组大鼠肺组织病理学比较（n＝10，±s）

与正常对照组比较：*P＜0.05；与肺气肿模型组比较：ΔP＜0.05

组别MLI（μm）MAN（个／102mm）正常对照40.38±3.144.73±1.01肺气肿模型50.88±2.34*2.28±0.89*BMSC治疗45.63±1.60Δ3.90±0.62Δ

3 讨论

COPD的发病与机体肺组织接触有害气体和微小颗粒引起的异常炎症反应有关。吸烟是COPD主要的危险因素，但也只有20%～30%的吸烟者最终发展为COPD［2］，这些人共同的特点是具有严重的气道炎性反应，最重要的是在停止吸烟的情况下，这种炎症反应不会因此停止。Agusti et al［3］首先提出COPD存在自身免疫应答假说。目前认为，COPD是由T淋巴细胞参与的慢性炎症反应和自身免疫反应所引起的疾病。

IL-17是由T淋巴细胞及多种细胞分泌的一类炎性介质。研究［4－5］表明，COPD患者呼吸道IL-17A／F的表达是上调的，且IL-17A基因缺失将会降低香烟烟雾引起的炎症和肺泡Ⅱ型细胞凋亡。IL-17诱导呼吸道上皮细胞分泌中性粒细胞趋化因子IL-8，增强ICAM-1表达促进炎细胞的活化及黏附，使支气管上皮细胞变性、坏死、脱落，黏液分泌亢进，纤毛运动减退，炎症反复发作迁延不愈。另外，IL-17诱导中性粒细和肺泡巨噬细胞释放弹性蛋白酶，造成肺泡壁的断裂，肺大泡形成。本实验中肺气肿模型组血清与BALF中IL-17浓度较正常对照组明显增高，BMSC干预后IL-17水平的降低，表明IL-17与COPD形成过程有着密切联系。

IL-6是由淋巴细胞、单核／巨噬细胞等多种细胞产生的炎性介质。IL-6水平升高是COPD急性加重期的一个重要特征［6－7］，与小气道的炎症严重程度有关，且IL-6降低肺功能［8］。IL-6促进B细胞的分化及分泌抗体，使中性粒细胞氧化延缓凋亡，增加炎细胞的黏附作用及细胞外蛋白酶的活性。本研究结果显示，肺气肿模型组血清及BALF中IL-6的显著增高，与以往的研究相同，表明IL-6与COPD发生发展有相关性。

研究［1］表明通过全骨髓贴壁法可以获得BMSC。Weiss et al［9］对接受BMSC治疗的COPD患者进行为期2年的随访，结果显示BMSC对COPD的治疗具有安全性。BMSC分化为气道上皮细胞和肺泡Ⅱ型细胞修复受损的肺组织，分泌各类生长因子诱导细胞增生，增加肺小动脉的数量，缓解肺动脉高压和减轻肺血管的重塑［10］；BMSC作为免疫调节细胞，减轻肺局部异常免疫反应，从而为损伤肺组织的修复提供有利环境。体外实验［11－12］表明，BMSC和T淋巴细胞共培养，可抑制淋巴细胞、NK细胞的增殖，降低其分泌的炎性介质水平，从而减轻局部的炎症反应。

研究［13］表明，用熏烟和注射胰蛋白酶两种方法诱导的肺气肿模型病理学特点和血液中的IL-17无明显差异。本研究通过气管内注入PPE诱导COPD模型，病理学观察肺气肿模型组和BMSC治疗组肺组织均出现肺泡壁变薄，部分断裂，肺泡腔扩大。肺气肿模型组BALF中白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞百分比均有不同程度增高，表明中性粒细胞和淋巴细胞在COPD患者气道及肺泡局部聚集。肺气肿模型组血液和BALF中的IL-17、IL-6较正常组对照组明显升高，经BMSC干预后降低，表明BMSC可能是通过抑制淋巴细胞和中性粒细胞等炎症细胞产生IL-17、IL-6，从而抑制COPD的慢性炎症反应。本研究显示，BMSC干预后MAN较肺气肿模型组增大，MLI减小，表明BMSC对肺小叶有修复作用。但这种对肺小叶的修复机制是通过抑制局部炎性反应，还是通过BMSC的定向分化为肺泡上皮产生，亦或两者的协同作用，尚需进一步研究证实。而BMSC对COPD的进展发挥了明显的干预作用却是显而易见的。

综上所述，由于肺组织的特殊结构促使BMSC能够高比例的定植于受损的肺组织，BMSC对COPD的治疗作用可能是通过抑制炎性细胞的增殖分化，调节炎细胞和炎症介质水平来减少肺组织的损害。这将为临床探索治疗COPD的新方法提供重要参考。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on cytokines of IL-17，IL-6 in rat model of emphysema

Wang Liyan，Wu Qian，Wang Yefang，et al
（Dept of Geriatric Pulmonary Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore the mechanism of MSC treatment for COPD by studying the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on IL-6 and IL-17 in BALF and serum of emphysema model，as well as lung pathological changes.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups，normal control group，emphysema model group，BMSC treatment group.After establishing rat models of COPD through endotracheal injection which induced in porcine trypsin，biological treatment was given by injecting BMSC via rat caudal vein.All rats were executed two weeks later，observing the pathological changes of lung tissues and the total number of white blood cells，the percentage of neutrophils and lymphocytes in BALF and serum.Using the ELISA method to detect the level of IL-17 and IL-6 in serum and BALF.ResultsCompared with normal control group，the WBC total number，percentage of neutrophil and lymphocyte increased in BALF of emphysema model group and BMSC treatment group（P＜0.05），and BMSC treatment group was significantly lower than that in emphysema model group（P ＜0.05）；ELISA results showed that the level of IL-17，IL-6 in serum and BALF of emphysema model group and BMSC treatment group was significantly higher than normal control group，BMSC treatment group was lower than that in emphysema model group（P＜0.05）.Emphysema-like changes could be seen in emphysema model group and BMSC treatment，compared with emphysema model group the average lung tissue lining interval（MLI）in BMSC treatment group was decreased，while the mean alveolar number（MAN）per unit area was increased，and thedifference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells may have intervention effect on COPD，by regulating inflammation cell proliferation and chemotaxis to intervene the expression of IL-17 and IL-6，as well as promote the the damaged lung tissue to repair.

chronic obstructive pulmonary disease；bone marrow derived mesenchymal stem cell；IL-17；IL-6

R 563.3；R 392.4；R 392.114

1000－1492（2014）05－0572－05

2014－03－25接收

安徽省教育厅自然科学基金（编号：KJ2009A118）

安徽医科大学第一附属医院老年呼吸内科，合肥 230022

王丽雁，女，硕士研究生；

汪伟民，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangwm7＠tom.com