药用植物细胞悬浮培养产生次生代谢产物的研究进展*

刘 群，李天祥，李庆和，张伯礼

（天津中医药大学，天津 300193）

·综述·

药用植物细胞悬浮培养产生次生代谢产物的研究进展*

刘 群，李天祥，李庆和，张伯礼

（天津中医药大学，天津 300193）

细胞悬浮培养；次生代谢产物；研究进展

自20世纪50年代至今，植物细胞培养技术取得了重大的发展。目前被研究的植物有1 000多种，获得天然活性产物达500多种[1]。细胞悬浮培养是植物细胞培养技术的应用和发展，中国已建立了人参、西洋参、紫草等药用植物细胞悬浮培养体系，有效成分含量已达到或超过原植株[2]。

1 影响次生代谢产物积累的培养条件

1.1 愈伤组织及其接种量 生长力旺盛、表面颗粒突起、质地疏松、淡黄色的胚性愈伤组织是建立细胞悬浮系和提高次生代谢产物积累量的基础[3]。

悬浮细胞的生长具有群聚效应，细胞密度低，生长缓慢；细胞密度高，生长迅速，液泡变大，易积累有害物质，不利于悬浮细胞系的建立[4]。一般药用植物细胞悬浮培养的接种量在20.0～100.0 g/L。接种量的大小不仅影响细胞的生长量，也影响次生代谢的积累。王关林等[5]发现，在同一培养天数不同接种量的栀子悬浮细胞的收获量不同，而且在指数后期和静止期多糖含量显著下降。

1.2 培养基 培养基中的碳源、氮源、维生素、氨基酸以及植物生长激素等组成成分也影响了植物细胞的生长和代谢。

1.2.1 碳源 在药用植物细胞悬浮培养过程中最常用为蔗糖，浓度为2%～5%。提高药用植物细胞生长的碳源浓度，并不一定相应促进其次生代谢产物的积累。郭肖红等[6]发现，30 g/L蔗糖可使丹参不定根增殖倍数最高，60 g/L蔗糖最适合丹参酮ⅡA合成，低质量浓度蔗糖更利于原儿茶醛合成。

不同种类的碳源对植物细胞代谢有不同的影响。彭昕等[7]研究三叶青细胞悬浮培养发现以5%麦芽糖为碳源时细胞增殖倍数最高；以5%蔗糖为碳源时总黄酮含量最高。因此，应根据不同研究目的来筛选碳源的种类和浓度。

1.2.2 氮源 一般情况下，硝态氮水平高利于细胞增殖和胚性愈伤组织的诱导，铵态氮水平高促进组织的器官分化和体细胞胚胎形成[8]。高艳丽等[9]发现，硝态氮和铵态氮比例为5∶1时，甘草细胞获最大生物量，以铵态氮为氮源，黄酮类含量最高。

1.2.3 植物生长激素 生长素与细胞分裂素比值适中时,促进愈伤组织生长[10]。激素种类和配比对植物细胞的生长和次生代谢产物的积累有着显著的影响。Zhao J等[11]在玫瑰红细胞悬浮培养过程中发现，吲哚-3-乙酸（IAA）与激动素（KT）或6-苄胺基腺嘌呤（6-BA）的组合更利于提高生物碱含量。李蕤等[12]研究发现当6-苄胺基腺嘌呤（6-BA）与吲哚-3-乙酸（IAA）为1.0∶0.4时细胞收获量最大。

1.3 物理因素的培养条件 在悬浮培养过程中，光照、温度、pH值、摇床转速、细胞生长周期等也不容忽视。

1.3.1 光照 光照通过光合作用和光形态建成这两种途径影响黄酮类、蒽醌类等次生代谢物的积累[13]。一般所需光强在1 000～2 000 lx，光照时间为每天14 h。光照强度的大小和光质应根据不同植物和研究目的来选择。李春斌等[14]发现，在2 000 lx光强范围内，银杏细胞增长随光强的加大而增强，光强大于2 000 lx时，有下降趋势，但培养物中黄酮的含量却随光强的增加而增加。另外，红光最利于银杏细胞的生长，但黄酮含量最低，蓝光下细胞生长最慢，白光下细胞的生物量和黄酮含量居中。

1.3.2 pH值 目前研究认为pH值影响培养细胞的质膜透性、细胞呼吸代谢及胞内离子竞争等[15]。细胞悬浮培养所需pH值为5.5～6.0。不同的pH值对细胞内不同有效物质的积累影响是不一样的，王娟等[13]研究发现较低的pH值有利于人参皂苷Rb1的合成，较高的pH值有利于西洋参多糖的合成。

1.3.3 温度 温度过高或过低都不利于植物细胞的生长和次生代谢产物的积累。在研究主要因素对菘蓝下胚轴细胞悬浮培养影响的过程中，发现温度的影响最大，20℃为最适温度[16]。

1.3.4 摇床转速 摇床转速对细胞生长也有一定的影响。研究发现[17]，长春花愈伤组织细胞120 r/min转速下20 d后的平均值鲜重最大。

1.4 细胞培养周期 药用植物细胞的培养生长周期呈“S”型曲线，培养周期一般为14～20 d[18]。次生代谢产物的合成量也会随细胞不同生长期而改变，一般是同步的，华萍等[19]发现茶叶细胞生长和茶氨酸积累高峰期在第19天～第22天出现，以培养19～22d为宜。

2 提高次生代谢产物积累的方法

2.1 诱导子的加入 诱导子为能引起植物胞内代谢趋向于向次生代谢产物合成方向转变的胁迫因子[20]。一种诱导子的添加不一定对同一种植物的多种次生代谢产物的积累都起到促进作用。研究显示[21]，茉莉酸甲酯的添加对葡萄的总酚和白藜芦醇的含量的提高都有促进作用，但对花青素的含量有抑制作用。赵微等[22]发现高温和低温均显著促进了白桦总三萜的合成和丙二醛的积累。

2.2 前体化合物的加入 在细胞悬浮培养中加入次生代谢产物的前体化合物对提高代谢产物的产量是非常有效的[23]。加入前体物质异戊二烯、牻牛儿醇对银杏悬浮细胞的生长及银杏内酯B的积累均有一定的促进作用[24]。

2.3 培养方法的改进 在植物细胞培养过程中，还可以建立有效的培养方法来获得高产量有效物质。

2.3.1 发状根培养 发状根是植物受到发根农杆菌的侵染时产生的呈发状分支的不定根[25]。发状根生长迅速，产生的次生代谢产物的含量高[26]。研究表明[27]，发状根中的总生物碱含量高于长春花的原植株和愈伤组织。发状根培养具有生长迅速、激素自养、次生代谢产物稳定且往往比植物自身合成的含量还要高等多方面的优点[28]。但是大多数单子叶植物受发根农杆菌感染后不能产生发状根。

2.3.2 两相培养 两相培养是通过细胞在水相中生长，合成的脂溶性次生代谢物质可以转移至有机相中来提高代谢物的量。目前运用较多的是两液相培养[29]。吴兆亮等[30]研究表明，在悬浮培养过程中加入有机溶剂可使红豆杉的紫杉醇的释放率提高近2倍。

2.3.3 基因工程的应用 利用基因工程技术对植物细胞体内基因进行调控来提高代谢产物产量是目前一种先进的应用方法。通过反义技术，可以将反义DNA或RNA片段导入植物细胞，使控制代谢的关键酶活性受调控，从而提高目的物的含量[31]。在薄荷中导入反义构建的薄荷呋喃合成酶基因，降低了薄荷油中薄荷呋喃的含量，改善了薄荷油的品质[32]。

3 讨论

经过近几十年的发展，植物细胞培养技术日趋成熟，人参产生的人参皂苷、紫草产生的紫草宁、黄连产生的小檗碱等已经通过植物细胞培养技术实现了工业化生产[33]。但高产而又稳定的细胞系难以筛选；植物细胞的生长周期过长，以及污染和褐化问题难以彻底解决；植物细胞要求的生长环境复杂，生物细胞反应器工艺难以满足工业化生产要求；植物细胞培养成本高，但代谢产物含量不稳定，其不一定高于原植物，某些植物细胞次生代谢信号调控十分复杂[34]，难以控制。可见，利用植物细胞培养产生有效次生代谢产物的技术有待进一步完善。

4 展望

放眼未来，利用植物细胞培养技术快速生产有效代谢产物的方法将会有广阔的发展空间。要想实现植物细胞培养的工业化，需要从以下方面努力：获取和筛选高产，稳定的细胞系；探索并掌握植物细胞次生代谢信号调控机制，合理、准确地调控其悬浮细胞生长和代谢，以提高代谢产物产量；改善植物生物反应器的工艺和技术，提供植物细胞培养的最适环境；充分利用基因工程先进技术，对次生代谢中的关键酶基因进行修饰和改造，提高次生代谢物的产量[35]。无疑，通过上述途径，在不久的将来，成熟的细胞培养工业化生产体系能为人类防治疾病提供丰富的物质基础。

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R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0375-03

2014-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.16

天津市科技支撑计划项目（10ZCZDSY12400）。

刘 群（1989-），女，硕士研究生，研究方向为中药质量控制与资源开发。

李天祥，E-mail:litianxiang612@sina.com。