大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立的关键性问题*

侯梦梦，邢冬梅，刘 璇，华声瑜

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立的关键性问题*

侯梦梦，邢冬梅，刘 璇，华声瑜

（天津中医药大学中医药研究院，天津 300193）

心肌缺血再灌注损伤模型是研究心肌缺血预适应机制、评价抗心肌缺血及心律失常药物疗效的经典动物模型，传统实验操作仍有较多缺陷，需要对造模的关键技术不断完善。加强该模型术前处理、术中操作和术后护理3个方面的研究，分析心肌缺血再灌注损伤实验大鼠模型成功建立的关键性问题，并提出解决办法，组建心肌缺血再灌注损伤模型的规范化造模流程。

心肌缺血再灌注损伤模型；关键性问题；术前处理；术中操作；术后护理

目前，冠状动脉再通是急性心肌梗死公认的有效治疗方法，然而，冠状动脉再通又存在再灌注损伤问题，因而对再灌注损伤的研究及防治已成为研究的热点问题。Jennings等[1]于1960年针对组织细胞低灌流缺血后获得血液再供应时，组织细胞缺血性损害未得以减轻或恢复，缺血性损伤反而加重的病理变化首次提出了心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的概念。目前心肌梗死的临床治疗手段已由传统的药物治疗逐渐上升到基因治疗、细胞治疗等方法，但任何方法在临床应用前都要经过动物实验研究。近些年，MIRI模型已经成为抗MIRI临床前研究的重要手段，是指导临床应用、复杂新药开发的重要研究方法。但是在MIRI造模过程的实践中，存在较多难以把握的关键技术，能否成功建立MIRI模型已成为值得关注的问题。

1 术前处理

1.1 实验动物的确定 MIRI模型旨在通过结扎左冠状动脉前降支，造成急性心肌缺血，并在预定时间内予以再灌注，已成为模拟人类缺血性心脏病恢复血供必需的实验方法[2]。现代研究中，用于建立MIRI模型的常用实验动物有：猪、犬、兔、羊、小鼠及大鼠等[3]。实验动物的选择依照接近人体病理生理的原则，选择进化关系上接近人类的大鼠，其基因背景清楚、繁殖周期短、冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、模型重复率高，结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌梗死是目前国内外公认的模型制备方法[4]。在实验过程中，建立MIRI模型应选择为鼠龄9～11周，体质量为220～280 g的大鼠。

1.2 麻醉处理 随着麻醉技术的飞速发展，采用现代麻醉药物传递系统理念，结合传统麻醉药物的施药特点、动物的反应，摒除毒性作用较大的乌拉坦和麻醉诱导时间较长的水合氯醛，采用戊巴比妥钠进行麻醉，其麻醉诱导时间短，对心脏毒性小，且大鼠术后苏醒快，剂量易掌握[5]。在麻醉过程中，应注意下面几点：1）麻醉药现用现配，防止日久变质。2）实验大鼠均严格称质量，精确计算麻醉药量，3%的戊巴比妥钠腹腔注射剂量1.5 mL/kg[6]。3）麻醉药尽量一次性注射到实验大鼠的腹腔内，避免中途补药造成死亡，若因种种原因未将麻醉药注射完全，应改用其他待做大鼠麻醉[7]。4）在麻醉剂给予过程中，基础给药量确定后，应根据动物对麻醉药的反应，适时对给药量进行微调[6]。5）实验中加用1%的普鲁卡因进行局部麻醉，可有效减轻大鼠的疼痛反应，降低麻醉药的使用量，降低呼吸抑制作用。6）麻醉期间，使用37℃的电热毯进行保温。

2 术中操作

2.1 开胸方式 曾有研究在实验过程中将肋骨剪断，扩大手术视野，对大鼠造成较大损伤，极易引起心律失常致死[8]。在实验过程中，在麻醉后背位固定大鼠，首先用手触摸其心尖搏动处，确定心脏在胸腔中的大体位置。沿胸骨左缘心脏搏动处纵向剪开皮肤2～3 cm，用止血钳逐层分离皮下肌肉，暴露左第3、4肋[9]。再用16 cm弯头止血钳迅速沿胸骨左缘3、4肋间隙插入胸腔分开肋骨，将心脏轻柔迅速的挤出胸腔，挂线结扎，结果显示成功率较高，改良方法重视细节上对模型制备的操作，明确指出手术时视野、心脏固定的难易程度、大鼠胸腔的正常结构等方面的关键性问题，综合控制大鼠在开胸过程中的情况，保证模型制作的成功率。在实验中应注意以下几个状况：1）在大鼠开胸前，应仔细剪除大鼠胸部毛发，清理后可使用生理盐水或碘伏将皮肤擦干净，避免开胸后毛发贴在心脏表面与神经、血管混淆，影响结扎操作[10]。2）若出现胸腔粘连，用手术剪轻轻将心包膜撕裂后再将心脏挤出胸腔，然后按照上面步骤进行操作。3）若出现体质量过重或者过轻以及罕见的右位心现象，在术前超声过程中进行标记[11]，便于找到正确的位置进行开胸。4）实验总结发现，应注重机体病理状态，摒弃外援呼吸系统，每隔2～5 min用棉签清理口腔至呼吸道中的分泌物，防止大鼠窒息死亡。

2.2 结扎过程的关键性问题

2.2.1 结扎操作 结扎前于心脏大静脉处放1根实心玻璃丝引线（1.5～2.0 mm），石蜡油润滑后[7]，用6/0无创缝合针于左心耳根部下方2 mm处穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针[12]，进针深度为0.5～1.0 mm、宽度为2.0～3.0 mm[13]，此时稍微轻轻用力拉起缝合线两端，心尖的左室前壁失去原有光泽而显暗灰色或青紫色，左室收缩活动减弱及此过程动态心电图中出现ST段弓背向上持续抬高和R波增高的现象，初步判断缝合线牵拉住左冠状动脉前降支，结扎位置准确[14]。若出现因局部刺激导致心肌苍白，之后很快恢复正常的现象，或者未见到ST段弓背向上持续抬高和R波增高的情况，则表明结扎未成功，立即轻轻抽出缝合线，重新按照以上步骤进行再次结扎操作[15]。在结扎过程中注意以下几点：1）进针位置：尽量一次成功，由于重复缝扎会束缚较多的心肌组织，造成机械性损伤，易致大鼠胸腔粘连，严重影响模型的稳定性。2）进针深浅：进针深易穿透心室壁，造成大量出血，死亡率较高，进针浅易穿过心肌表层，未能准确结扎到血管，均会导致模型建立失败[16]。3）结扎松紧度：结扎过紧易引发血管断裂，过松易造成不完全性缺血，均会影响造模的成功率。为避免这样的问题出现，模型建立时为保证手术的稳定均一性，应由同一人完成整个手术操作。4）心脏出血：用干纱布适当力度压迫出血点，止血效果显著，切记盲目使用钳夹以防造成更大的损伤，降低模型成功率。5）摒弃再灌注时将活结打开的传统方法，现采用实心玻璃丝引线[7]，再灌注时直接将其抽出的手段，防止缝合线牵扯心肌组织，避免出现不可逆损伤状况。

2.2.2 结扎后处理 结扎后0～30 min大鼠发生房颤、室速等心律失常的几率较大，此时在伤口缝合处滴入少量治疗快速室性心律失常的药物利多卡因（生理盐水稀释100倍），使其渗入到心脏组织中，并适当给与心外膜按摩，有效缓解心律失常的发生，减少因心律失常所引起的死亡[17-18]。

2.3 缺血及再灌注时间选择

2.3.1 缺血时间 模型建立过程中，缺血心肌组织在恢复血液灌注后发生的细胞死亡或功能降低、引起超微结构、功能、代谢及电生理方面发生进一步的损伤，根据缺血时间的长短其表现形式也各有不同，分别为血管损伤、再灌注心律失常以及心肌梗死[19]。缺血时间小于5 min的心肌处于血管性损伤状态，若此时恢复再灌注后缺血心电图迅速恢复正常状态，心肌的收缩和舒张功能能够迅速恢复正常；缺血时间在5～20 min的心肌功能、形态结构尚未发生较大改变，再灌注后主要表现为心律失常；缺血时间大于或等于30 min的心肌处于不可逆性损伤状态，直接造成心肌梗死。在实验过程中，为模拟临床病理状态，心肌细胞形成不可逆性损伤，缺血时间一般定为30～40 min[16]。

2.3.2 再灌注时间 缺血30～40 min后，将实心玻璃丝引线拉出来，进行再灌注，大量氧自由基生成，其通过不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应生成丙二醛（MDA），通过多种途径破坏细胞膜结构，另外，氧自由基还能促进钙超载，胞浆内游离钙的增加进一步加速自由基的产生，加重再灌注损伤[20]。实验证明，造模过程中的再灌注时限呈多样化，再灌注1、2、3 h到24 h等，模型建立后心肌梗死面积均在20%～30%，表明MIRI模型在各种在灌注时限均可建立成功[21-24]。因此在实验研究中，应根据实验需要，采取不同的再灌注时间以及采用再灌期间连续给药的方式，来评价药物的治疗效果[12]。

3 术后处理

结扎后将心脏轻轻地迅速推进胸腔，选择三角针、最细型号缝线，右手持文式止血钳稍微提起胸部肌肉，左手迅速沿与切口垂直方向挤压胸腔[25]。采用肌腱缝合的方法按层次由深到浅分层，将相同类型的组织对齐缝合，以组织对合后不发生裂隙为宜，勿留死腔，以防积血、积液延缓伤口愈合和感染，由于肌肉分离的较碎、肋间肌肉较薄不易缝合，缝合过程中要用小针细线，避免打结脱线导致气胸，提高模型成功率。手术结束后，将大鼠放在电热毯上（37℃）至苏醒，存活的大鼠放入笼中单独饲养（防止术后大鼠的伤口感染或者因血腥味相互打斗）直到取材时间，术后肌肉注射青霉素预防感染[26]或给予姜黄素[27]腹腔注射治疗。

4 结语

综上所述，模拟人类心肌梗死的病理现象，传统建立MIRI模型的实验操作仍有较多缺陷，MIRI模型作为指导临床研究、复杂药效评价的重要方法需要不断完善，其成功与否主要取决于以上几个环节中的关键性操作。组建MIRI模型的规范化造模流程是进行心血管疾病研究和治疗的根基，整个心血管疾病的研究工作都要围绕建立成功的MIRI模型的基础上展开，因此，建立MIRI模型的成功与否，对于其后一系列研究是否成功有着重要意义。

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Key troubles in reproducing myocardial ischemia and reperfusion injury in rats

HOU Meng-meng,XING Dong-mei,LIU Xuan,HUA Sheng-yu
（Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China）

The animal model of myocardial ischemia and reperfusion injury is a classic model in researching the preadaptation mechanism of myocardial ischemia,evaluating the therapeutic effect of the drugs of antimyocardial ischemia and irrhythmia.There are still many deficiencies in the classic experimental operation.It is necessary for the continuing improving some key techniques in modeling,strengthening the study on the preoperative treating,intra-operative procedure and post-operative nursing,analyzing the key troubles in reproducing these models of myocardial ischemia and reperfusion injury and providing the resolving method and establishing a normal process in modeling myocardial ischemia-reperfusion injury.

model of myocardial ischemia reperfusion injury;key trouble;preoperative treatment;intraoperative procedure;postoperative care

R541.4

：A

：1673－9043（2014）06－0323-04

2014-08-20）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.02

国家自然科学基金项目（81202798）；教育部“创新团队发展计划”资助项目（IRT1276）；天津市高等学校科技发展基金计划项目（20110208）。

侯梦梦（1991-），女，硕士研究生，主要研究方向为中医药防治心脑血管疾病的中药药理学研究。

华声瑜，E-mail:bravo2008@163.com。