HPLC法测定四季柚的黄烷酮类化合物

吴 丹, 刘 英, 陈健初

(1. 浙江大学 生物系统工程与食品科学学院, 浙江 杭州 310058；2. 杭州市余杭区农产品监测中心, 浙江 杭州 311100)

0 引 言

柚子(Citrusgrandis(L. ) Osbeck) 是芸香科柑桔属植物，盛产于我国东南及南方，种植面积和产量均居世界首位。四季柚为柚子的优良品系之一，具有滋阴、清热、开胃、消食、解酒、降压降脂、清肺等功效[1-3]。柚果实中不仅含有多种人体必需营养元素，还含有一些非营养性生理活性成分，如黄烷酮糖苷类化合物，包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等，这些成分具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗微生物、抑酶、降血糖、降血压、预防动脉粥样硬化等活性[4-8]。

本文建立了一种高效液相色谱法(HPLC)，该方法可同时测定四季柚果汁中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3种黄烷酮糖苷类化合物含量。3种黄烷酮糖苷类化合物的结构见图1。

图1 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的化学结构式

一般黄烷酮检测方法包括光谱法[9-10]、色谱法[11-13]、毛细管电泳法[14]、色谱-质谱联用法[15]等，以HPLC最为常用，通常通过梯度洗脱方式获得理想的图谱数据。本文通过等梯度洗脱HPLC法同时测定3种黄烷酮糖苷类化合物，简便快捷、灵敏度高、重新性好，为四季柚的黄酮类物质检测提供技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Waters2696-2996，PDA测器)；SOCOREX系列移液枪；Mettler Toledo GB204 万分之一分析天平(上海天平仪器厂)；DKS-24型 电热恒温水浴锅(杭州蓝天化验仪器厂)；DFT-200手提式高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)；YP1200电子天平(上海第二天平仪器厂)；离心机(Eppedorf)；SHZⅢ型循环水多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

标准品：橙皮苷(纯度≥98%)，柚皮苷(纯度95%)，新橙皮苷(纯度90%)，购于Sigma公司。

试剂：乙酸(AR)，甲醇(HPLC级和AR)，乙醇(AR)购于杭州双林化工试剂厂，娃哈哈纯净水购于超市。

1.2 标准溶液配制

准确称取柚皮苷9.0 mg ，新橙皮苷7.8 mg, 橙皮苷4.4 mg，用色谱级甲醇溶解，并完全转移到50 mL容量瓶中用甲醇定容制成混标工作液。

1.3 色谱条件

色谱柱：安捷伦C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) ；流动相：水∶甲醇∶乙酸=56∶40∶4；检测波长283 nm；流量1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

1.4 样品处理

四季柚样品取之浙江苍南县，一份为未成熟样品，9月底份采摘；另一份为成熟样品11月底采摘。采下后将果皮和果肉剥离，果肉部分置于四层纱布中手工挤汁得到四季柚果汁，果汁取15 mL于50 mL三角瓶中，加入15 mL甲醇超声20 min，将汁液转入离心管，4 000转离心10 min, 取上清液备用。

1.5 高效液相色谱测定

将配制好的标准溶液和处理好的样品溶液按照色谱条件进样并进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

取混标工作液稀释到适当浓度进行HPLC分析。研究表明,当流速为1.0 mL/min时，3种黄烷酮标准品的分离效果最好，在10 min内得到良好的分离图谱，3种黄烷酮化合物的保留时间分别为：柚皮苷7.92 min，橙皮苷8.71 min，新橙皮苷9.59 min(见图2)。

图2 混标HPLC谱图(依次为柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷)

2.2 线性范围和检出限

分别取混标工作液0，2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 mL于6只10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，得到系列浓度，每一浓度分别平行测定3次，以平均峰面积y为纵坐标，质量浓度x为横坐标作图，拟合线性回归方程,见表1。柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的线性回归方程R2>0.999 3，显示了较好的线性关系。

表1 3种黄烷酮标准曲线的线性范围及回归方程

2.3 精密度、稳定性及重复性

取混合对照工作液稀释5倍，连续测定6次，计算得到3种黄烷酮的峰面积的相对标准偏差(RSD)均不高于2.5%，表明仪器精密度良好。取5倍稀释混合标准液，在室温下放置1、2、3、4、5 h后进样分析，得到3种黄烷酮物质的峰面积的RSD均不高于4.5%，表明该方法稳定性良好，待测溶液在5 h内稳定。取5倍稀释混合标准液6份，在上述色谱条件下测定，结果柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的平均含量分别为35.20，30.16，18.00 μg/mL，RSD分别为2.22%，3.33%，2.27%。表明该方法重复性良好。

2.4 加标回收率

准确称取已知含量的样品6份，分别按照相当于样品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的80%，100%，120%的量加入各对照品，制备待测样品溶液，按色谱条件测定，计算得加样回收率为95%～103%。

2.5 样品测定

取处理后的成熟和未成熟的四季柚果汁样品各3份，按照色谱条件进行测定，根据回归方程计算含量，结果见表2。可以看到，四季柚果汁中3种黄烷酮类化合物的含量随成熟度有所不同，未成熟的四季柚果汁中以柚皮苷含量最高，其次为橙皮苷，新橙皮苷含量最低；而成熟果汁中以橙皮苷含量最高，柚皮苷含量有明显下降，而新橙皮苷没有检出。

表2 未成熟与成熟时期四季柚果汁中主要黄烷酮成分的含量

3 结 语

本文建立了同时测定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的HPLC法。经验证，该方法简便，表现出良好的线性、精密度、稳定性、重复性和准确度。可用于四季柚及其他柚子果汁或者果皮中的相关黄烷酮类物质含量的测定。

[1] 郭秀珠，陈巍，潘君慧，等．四季柚果实发育过程中可溶性糖及矿质元素变化[J]．福建农业学报, 2012，27(11)：1227-1230．

GUO Xiu -zhu，CHEN Wei，PAN Jun-hui，etal．Soluble Sugar and Mineral Contents of Sijiyou Pummelo during Development Period[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2012, 27(11): 1227-1230．

[2] 余 蕾. 四季柚醋饮料的研制[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(11)：5115 - 5116.

YU Lei. Study on Preparation of Siji Pomelo Vinegar Beverage[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009, 37(11)：5115 - 5116.

[3] 陈 巍, 郭秀珠, 黄品湖, 等. 四季柚生育期叶片和果实中矿质元素含量变化的研究[J]．植物营养与肥料学报, 2013，19(3)：664 - 669.

CHEN Wei, GUO Xiu-zhu,HUANG Pin-hu,etal. Variations of mineral elements contents in Sijiyou pummelo leaves and fruits during the development period[J]. Joumal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2013，19(3)：664 - 669.

[4] 张九凯. 瓯柑和胡柚果实黄酮类化合物组分鉴定, 分离纯化及生物活性研究[D]. 杭州：浙江大学, 2013.

[5] 李黎明, 邹吉航. 柚类黄酮抗氧化作用的研究[J]. 广州化工，2011， 39(18): 79-81.

LI Ming, ZOU Ji-hang. Study on the Antioxidant Activity of Flavonoids from Pomelo[J]. GuangZhou Chemical Industry and Technology, 2011, 39(18): 79-81.

[6] Tripoli E, Guardia M, Giammanco S,etal. Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties: A review[J]. Food Chemistry, 2007, 104(2)：466-479

[7] Serafini M, Bellocco R, Wolk A,etal. Total antioxidant potential of fruit and vegetables and risk of gastric cancer[J]. Gastroenterology, 2002,123(4): 985-991.

[8] Kim H J，Coo T O，Yong B P,etal. Naringin alters the cbolesterol biosynthesis and antioxidant enzyme activities in LDL receptor-knockout mice under cholesterol fed condition[J]．Life Science, 2004,74:1621-1634.

[9] 邵 伟, 熊 泽, 李 昕. 橙皮中橙皮苷的分光光度法测定[J]. 光谱实验室, 2006, 22(5): 1044-1046.

SHAO Wei, XIONG Ze, LI Xin. Detection of Hesperidin in orange Skin by the UV-VIS Spectrophotometry[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory, 2006,22(5):1044-1046.

[10] Manthey J A. Fourier transform infrared spectroscopic analysis of the polymethoxylated flavone content of orange oil residues[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(9): 3215-3218.

[11] 黄高凌, 倪 辉, 胡 阳, 等. 蜜柚中主要苦味物质的快速测定方法研究[J]. 中国食品学报, 2009, 9(1): 208-213.

HUANG Gao-ling, NI Hui, HU Yang,etal.Determination of Main Bitter Substance in Guanxi Pomelo by High-Performance Liquid Chromatographic[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2009, 9(1): 208-213.

[12] 陈 超, 李淑贤, 王淑美, 等. HPLC 法同时测定复方脑得生有效部位中 4 种异黄酮的含量[J]. 分析测试学报, 2013, 32(4): 454-458.

CHEN Chao, LI Shu-xian, WANG Shu-mei,etal.Simultaneous Determination of Puerarin, 3-Methoxy Puerarin, Mirificin and Daidzin in the Bioactive Fraction of Naodesheng Prescription by RP-HPLC/UV Method[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2013, 32(4): 454-458.

[13] 牟 洋, 李顺兴, 陈丽惠, 等. 高效液相色谱法同时检测 4 种金线莲黄酮苷元及其在提取工艺评价中的应用[J]. 分析科学学报, 2013, 29(4): 465-468.

MU Yang, Li Shun-xin, CHEN li-hui,etal. Simultaneous Determination of Flavonoid Glycosides from Anoectochilus roxburghii by High Perfomance Liquid Chromatogrophy and Its Application for the Assessment of Extraction Technology[J]. Journal of Analytical Science, 2013, 29(4): 465-468.

[14] Wistuba D, Trapp O, Gel-Moreto N,etal. Stereoisomeric separation of flavanones and flavanone-7-O-glycosides by capillary electrophoresis and determination of interconversion barriers[J]. Analytical Chemistry, 2006; 78(10): 3424-3433.

[15] Motilva M J, Serra A, Macià A. Analysis of food polyphenols by ultra high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry: An overview[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1292: 66-82.