高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成

裘雅渔, 李巧玲, 程和勇

(1. 浙江大学 化学系， 浙江 杭州 310027； 2. 杭州师范大学 材料系， 浙江 杭州 310058)

0 引 言

黄秋葵单糖是从黄秋葵粗多糖酸水解后得到单糖组分,而黄秋葵粗多糖又是从黄秋葵嫩荚果中提取的水溶性成分。药理学研究表明,这种由水溶性纤维果胶、半乳聚糖和阿拉伯树胶等组成的黄秋葵粗多糖，具有保护肠胃、肝脏和皮肤粘膜作用[1～3]，并能刺激中枢神经，加速血液循环及促进新陈代谢和全身血管活化[4]，可防治因血管供血不足造成的心脏病、中风、骨质疏松及老年痴呆等疾病[5]，因此对黄秋葵粗多糖的成分研究很有必要。由于粗多糖由各种基本的中性单糖组成的，因此对单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节之一[6-8]。而单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征[9]，且往往同一待测样品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等可能含有许多类型的单糖[10-11]，所以单糖分析有其自身的特点，必须具有高效的分离技术，方可实现系列单糖的有效分离。罗利攀等用GC-MS方法[12]对不同产地的红景天多糖进行单糖组分分析，虽然MS检测器灵敏度很高，但需要对单糖进行衍生化处理，过程繁琐且衍生化是否充分大大影响测定结果；王松柏等用毛细管电泳法[13]测定防风粗多糖的单糖组分研究同样存在柱前衍生的缺点；其他诸如用HPLC反相柱方法测定[14]绞股蓝粗多糖的单糖组成存在分离度较差且流动相需用到大量乙腈等有毒试剂的明显缺点。

本研究采用高效液相渗透色谱方法，用示差折光质量型检测器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯阳离子交换树脂(Pb2+)柱(交联度为6%)，用去离子水做流动相建立适于黄秋葵多糖单糖组成测定的HPSEC新方法，达到灵敏度适宜、安全、快速、准确度高、操作简单和可在线大批量分析的目标。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

WATERS 2690液相色谱仪(美国WATERS 公司)；PRE-PACKED COLUMN RT POLYSPHER CH PB 分析糖柱(德国MERCK公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；EZ-DRY冷冻干燥机(美国Filter公司)。三氟乙酸(TFA，Merck公司)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂)；乙腈(TEDIA公司)；葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖(FRU)，丙三醇(Gly)均购自Sigma公司,其他试剂均为分析纯。黄秋葵多糖由本教研室制备。

1.2 黄秋葵多糖水解

精确称取黄秋葵多糖样品20.0 mg于安瓿中，分别加入2 mol/L TFA、2 mol/L H2SO4以及其混酸溶液2.0 mL，充氮气封管，110 ℃油浴分别水解2、4、6、8和10 h。冷却至室温，反应混合物1 000 r/min离心5 min，取上清液用0.3 mol/L NaOH溶液中和到约pH 7.0。

1.3 HPLC分析方法

采用WATERS 2690色谱系统,WATERS 2410 示差折光检测器，检测器温度40 ℃；柱温80 ℃；色谱柱为Polyspher CH PB (7.8 mm× 300 mm,made in Germany)；流速0.6 mL/min；流动相为去离子水；进样体积50 μL 。

1.4 分析原理与方法

1.4.1定量校正因子

以Gly(丙三醇)为内标，测定7种单糖的定量较正因子(fVs)。精密称取各标准单糖,并配制成2 mmol/L的母液，用时稀释为5个不同浓度的单糖溶液，并进行HPLC分析 (线性范围1～10 mmol)。

1.4.2相关系数与回归方程

以单糖的浓度X(Wi/Ws)与峰面积Y(Ai/As)作图，得回归方程与相关系数。求出各单糖的斜率b，即定量较正因子,

f0fVs=(Wi/Ws)/(Ai/As)

式中，Ai、As分别为Gly(丙三醇)和标准单糖的HPLC峰面积。

1.4.3摩尔比的计算

以Gly为内标，得到各单糖的峰面积与内标的峰面积比，乘以f/m(m为单糖的相对分子质量)，所得的值之比为摩尔比，即：

RVs=fVs(Ai/As)/m

2 结果与讨论

2.1 单糖对照品的HPLC分离

为实现黄秋葵粗多糖各组成单糖的高效分离，本实验对黄秋葵粗多糖可能包含的葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖(FRU))7种标准单糖及内标Gly的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表明，在2.5 mmol/L 醋酸水溶液，5 mmol/L醋酸水溶液 和 去离子水三者之间选择，去离子水中的分辨率高，分离效率最好，且样品容量大，因此去离子水为分离此7种单糖的较理想色谱分离条件。色谱峰的各峰保留时间依次为内标Gly,葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、果糖(FRU)以及木糖 (Xy1)。其中，内标Gly与其他单糖有很好的分离，其作为内标是合适的。

2.2 多糖水解样品制备条件优化

多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程，方可进行下一步的分析。本样品制备方法省略干燥过程，而将多糖水解液直接用NaOH中和(约中性)，这对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际意义。该制备方法的特点是：① 简化工艺，避免干燥损失。② 该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测定无影响。图1是黄秋葵多糖经TFA水解后，水解液经传统的干燥过程和未经干燥过程的HPLC图，图中未发现有明显吸收峰改变。③ 对多糖的含量、单糖组成等定量分析更有意义，因此过程几乎无糖损失，多糖水解液可直接进行在线大批量分析监测。

2.3 黄秋葵多糖样品的单糖组成分析

2.3.1多糖水解时间对分析结果的影响

考察了TFA的不同水解时间对黄秋葵多糖的组成测定结果的影响，结果如图2所示。黄秋葵多糖随水解时间的延长，测定的单糖摩尔比率增加，而在110 ℃用2 mmol/L TFA水解8 h后，水解已完全。可见，黄秋葵多糖经TFA水解8 h为其合适的水解时间。

(a) 干燥

(b) 无干燥

图2 黄秋葵多糖经TFA水解的时间对各组成单糖的测定影响

2.3.2不同酸水解对黄秋葵多糖的单糖组成测定的影响

选择用于水解多糖的合适种类的酸对准确测定单糖组成非常重要。本研究考察了常用的TFA、H2SO4及其混酸等不同酸水解方法对黄秋葵多糖的组成测定结果的影响(见图3)。结果表明，TFA和H2SO4对黄秋葵多糖的水解效果无明显影响，但TFA和H2SO4混酸水解该多糖时，单糖测定结果有一定的变化，其原因尚不清楚。所以，本实验选用TFA水解8 h为黄秋葵多糖的合适水解时间。

(a) 单糖标准品+丙三醇

(c) H2SO4

1-葡萄糖， 2-阿拉伯糖， 3-甘露糖， 4-半乳糖， 5-鼠李糖， 6-果糖， 7-木糖

图3 黄秋葵多糖的不同酸水解样品的色谱图

2.3.3黄秋葵多糖的单糖组成测定结果

由HPSEC-RID分析和摩尔比计算结果可知，黄秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成，其摩尔比为0.57∶1.00∶0.53∶3.50∶1.75∶1.25∶1.70，单糖测定的精密度(RSD，n=3)均低于4.5% ，测定结果重复性良好(见表1)。

3 结 语

本研究通过凝胶渗透HPSEC法，实现在普通实验室常用示差折光检测器和聚苯乙烯二乙烯基苯阳离子交换树脂(Pb2+)糖柱分离分析黄秋葵多糖的单糖组成，并可望推广用于其他多糖的单糖组成测定；同时，建立了黄秋葵多糖水解样品的制备优化工艺，避免了传统多糖水解产物的复杂干燥过程和进行繁琐的衍生化反应[15]；此外，该技术的完善，将在食品糖含量控制、大输液葡萄糖监测等领域有广阔的应用前景，并为发展黄秋葵多糖以及其他多糖的在线定性定量HPSEC-RID方法奠定基础。

表1 黄秋葵多糖的组成测定结果

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