混菌固态发酵降解羽毛生产饲料蛋白质工艺研究

杨 婷，廖美德，贺玉广，刘偲嘉，郑淡铿

（华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

混菌固态发酵降解羽毛生产饲料蛋白质工艺研究

杨 婷，廖美德*，贺玉广，刘偲嘉，郑淡铿

（华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

试验主要以酵母菌和淡紫拟青霉为发酵微生物，羽毛粉和麸皮为发酵底物，采用混菌固态发酵方式，探究基质初始水分以及麸皮与羽毛粉的比例等因素对饲料蛋白质生产的影响。试验结果表明，麸皮∶水=1∶1时最适合酵母菌的生长；麸皮∶水=1∶0.8时，最适合淡紫拟青霉的生长。以1∶1的水料比，当麸皮∶羽毛粉=7∶3时，最适合酵母菌的生长；而当麸皮∶羽毛粉=6∶4时，最适合淡紫拟青霉的生长。因此，混菌固体发酵降解羽毛生产饲料蛋白质最佳初始水分是1∶1，麸皮与羽毛比为7∶3。

酵母菌；淡紫拟青霉；固态发酵；羽毛；饲料蛋白质

近些年来，我国畜牧产业发展十分迅速，对于蛋白质类饲料的需求量越来越高。目前，我国的蛋白质资源主要依靠进口鱼粉，但存在一大弊端就是价格较贵，并不能满足我国需求[1]。因此，开发新的饲料蛋白质资源已经是目前研究的热点之一。家禽屠宰后，羽毛成为废弃物，并且产量逐年增加，严重污染环境[2]。羽毛中含有丰富的蛋白质，一般含量为75%～90%，主要是不易消化的角蛋白，其本身氨基酸不平衡，畜禽对其消化率较低。羽毛经过一定处理后，可以破坏其中较为稳定的结构，使得不溶于水的成分分解。我国每年的禽类羽毛产量可以达到70万t，按50%加工利用作为饲用羽毛粉，出粉率按80%计，则每年可加工羽毛粉约为30万t。羽毛粉用作饲料不仅能够降低成本，补充我国饲料蛋白质的不足，还能解决环境污染，变废为宝[3]。虽然羽毛粉角蛋白结构变得相对松散，但其消化率与大豆、豆粕等优质蛋白质饲料相比仍有很大差距，这严重限制其在畜禽配合饲料中的应用。目前，高压水解羽毛粉在配合饲料中的最大使用量为5%，超量使用会导致动物营养不良，生长发育受阻[4]。实验室在筛选羽毛角蛋白降解菌的过程中发现，淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）PL-HN-16菌株具有良好的角蛋白酶活性[5]。通过角蛋白酶降解羽毛角蛋白，可以显著提高其消化率[6-7]。因此，本试验用淡紫拟青霉和酵母菌为混合发酵微生物，羽毛粉和麸皮为混合发酵底物，对混菌固态发酵初始水分和羽毛粉添加比例进行研究，为羽毛粉和麸皮混菌固态发酵开发新型蛋白饲料提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

淡紫拟青霉菌株（PL-HN-16）和酵母菌菌株：华南农业大学实验室保存；羽毛粉：广州康顺饲料添加剂厂提供；麸皮：广州市花鸟鱼虫市场购买。

1.2 试验方法

1.2.1 淡紫拟青霉固体种子制备

将淡紫拟青霉接种到PDA固体培养基上，待菌落表面形成大量孢子后，用无菌水反复洗涤孢子，合并洗涤液即为孢子悬液，按添加量的1%加入灭菌后的麸皮固体培养基中，28℃恒温培养箱中培养48 h备用。

1.2.2 酵母菌固体种子制备

将酵母菌接种到LB液体培养基上，30℃，180 rpm恒温培养箱中培养24 h后，按添加量的1%加入灭菌的麸皮固体培养基中，28℃恒温培养箱中培养48 h备用。

1.2.3 初始水分固态发酵的影响

以麸皮为发酵底物，设置不同初始水分（底物∶水=1∶1.2、1∶1、1∶0.8和1∶0.6），混合均匀后灭菌，分别接入酵母菌固体种子2 g和淡紫拟青霉固体种子2 g，28℃恒温培养箱培养，定时观察并用血球计数板法计数[5]。筛选出酵母菌与淡紫拟青霉培养基的麸皮与水分最佳配比后，选择一个水平同时接种酵母菌和淡紫拟青霉，与同一配比的单一菌发酵结果进行比较。

1.2.4 麸皮与羽毛粉的最佳配比探索

试验设置3个不同处理，分别是麸皮∶羽毛= 1∶1、3∶2和7∶3，分别接入酵母菌固体种子2 g和淡紫拟青霉固体种子2 g，28℃恒温培养箱培养，定时观察并用血球计数板法计数。筛选出酵母菌与淡紫拟青霉培养基的麸皮与羽毛粉的最佳配比后，选择一个水平同时接种酵母菌和淡紫拟青霉，与同一配比的单一菌发酵结果进行比较。

2 试验结果

2.1 对酵母菌生长的影响

不同料水比条件下酵母菌的生长曲线见图1。

图1 不同料水比条件下酵母菌的生长曲线

由图1可知，当麸皮与水比例为1∶0.8、1∶1和1∶1.2时酵母菌的生长情况较好，以1∶1的配比为最佳。酵母菌发酵14 h后，其菌密度开始进入对数生长期，发酵约40 h菌密度趋向稳定，转入衰退期。

2.2 对淡紫拟青霉生长的影响

不同料水比条件下淡紫拟青霉的生长曲线见图2。

图2 不同料水比条件下淡紫拟青霉的生长曲线

由图2可见，培养基中麸皮与水的比例为1∶0.8、1∶1和1∶1.2时淡紫拟青霉的生长情况较好，以1∶0.8的配比为最佳。淡紫拟青霉发酵32 h后，其产孢量开始进入对数生长期，发酵约80 h孢子密度趋向稳定，转入衰退期。

2.3 最佳初始水分下混菌发酵和单菌发酵的差异

1∶1 的料水比条件下双菌的生长曲线见图3。

图3 1∶1的料水比条件下对双菌的生长曲线

由图3可见，酵母菌培养基中，麸皮与水的最佳配比为1∶1，淡紫拟青霉培养基中麸皮与水的最佳配比为1∶0.8，考虑到酵母菌为单细胞真菌，大多以出芽方式进行繁殖，而淡紫拟青霉是以产孢的方式进行繁殖，其繁殖速度远大于酵母菌，选择双菌培养基的配比时应该优先考虑酵母菌的最佳配比，故选择1∶1为双菌培养基的麸皮与水的配比。在料水比1∶1条件下，分别进行酵母菌、淡紫拟青霉、酵母菌与淡紫拟青霉混菌发酵，用血球计数板法记录下不同发酵时期每g培养基上酵母菌和淡紫拟青霉孢子数量。由图3可见，在料水比1∶1条件下，酵母菌混菌条件下生长比单菌条件下生长要好；淡紫拟青霉混菌培养时，发酵初期出现颉颃效应，酵母菌生长在一定程度上会抑制淡紫拟青霉生长，随着酵母菌的数量趋向稳定期，淡紫拟青霉的生长速度增加，其生长情况有所改善。总体来看，酵母菌与淡紫拟青霉双菌培养，发酵初期酵母菌的生长情况优于单一酵母菌培养情况，发酵后期淡紫拟青霉的生长情况优于单一淡紫拟青霉培养情况。

2.4 不同配比的麸皮与羽毛对酵母菌生长的影响

不同配比的麸皮与羽毛粉条件下酵母菌的生长曲线见图4。

图4 不同配比的麸皮与羽毛粉条件下酵母菌的生长曲线

由图4可见，用血球计数板法记录下不同发酵时期每g培养基上酵母菌的数量，绘制出不同配比的麸皮与羽毛粉条件下酵母菌的生长曲线。在培养基中麸皮与羽毛粉的比例为5∶5、6∶4、7∶3时，酵母菌的生长情况差别不大，但以7∶3的配比为最佳。酵母菌发酵8 h后其菌密度开始进入对数生长期，发酵约60 h菌密度趋向稳定，转入衰退期。

2.5 不同配比的麸皮与羽毛对淡紫拟青霉的影响

不同配比的麸皮与羽毛粉条件下淡紫拟青霉的生长曲线见图5。

图5 不同配比的麸皮与羽毛粉条件下淡紫拟青霉的生长曲线

由图5可见，用血球计数板法记录不同发酵时期每g培养基上淡紫拟青霉孢子量，再用淡紫拟青霉的产孢量评价其生长情况，根据孢子量绘制出不同配比的麸皮与水条件下酵母菌的生长曲线。在培养基中麸皮与羽毛粉的比例为5∶5、6∶4和7∶3时，淡紫拟青霉的生长情况差别不大，但以6∶4配比为最佳。淡紫拟青霉发酵14 h后其产孢量进入对数生长期，发酵约86 h产孢量趋向稳定，转入衰退期。

2.6 最佳麸皮与羽毛的配比对混菌发酵和单菌发酵的影响

麸皮与羽毛粉比例为7∶3条件下双菌的生长曲线见图6。

图6 麸皮与羽毛粉比例为7∶3条件下双菌的生长曲线

由图6可见，在1∶1的料水比条件下，酵母菌培养以麸皮与羽毛粉的比例为7∶3最佳配比，淡紫拟青霉培养以麸皮与羽毛粉的比例为6∶4最佳配比，考虑到酵母菌为单细胞真菌，大多以出芽的方式进行繁殖，而淡紫拟青霉是以产孢的方式进行繁殖，其繁殖速度远＞酵母菌，且淡紫拟青霉3组不同配比的发酵结果差距较小，故选择7∶3为双菌培养基的麸皮与羽毛粉的配比。在含水量50%、麸皮与羽毛粉7∶3条件下，分别接种酵母菌、淡紫拟青霉、酵母菌与淡紫拟青霉，用血球计数板法记录下不同发酵时期每g培养基上酵母菌和淡紫拟青霉孢子数量，绘制出1∶1的料水比条件下酵母菌和淡紫拟青霉单一培养与共同培养的生长曲线。由图5可见，在料水比1∶1、麸皮与羽毛粉7∶3条件下，发酵初期，共同培养的酵母菌与淡紫拟青霉的生长速度均快于单一菌培养。随着发酵的进行，共同培养的淡紫拟青霉产孢速度开始低于单一培养，在共同培养的酵母菌密度开始下降时，单一酵母菌仍处于增长期。

3 讨论

混菌固态发酵技术广泛应用于饲料行业，通过混菌固态发酵，利用微生物之间的协同、互补作用，发挥正组合效应，可以提高发酵产品蛋白质含量和品质[8]。麸皮中含有水分12.2%、蛋白质14.1%、脂肪3.9%、淀粉53.6%、粗纤维10.5%和灰分5.7%，是常见的饲料来源。具有来源广、成本低、易加工等优点，但直接作为饲料则其营养价值较低[9-10]。通过微生物发酵，可提高麸皮中的粗蛋白质含量，进一步提高麸皮的利用价值。羽毛粉因其所含硬性蛋白质而未能得到很好地利用，从而一直被当成废弃物，污染着生态环境。通过生物发酵，可以将羽毛粉中的蛋白质废物转变为可消化的蛋白质和氨基酸，变废为宝，用于饲料蛋白质的生产[11]。淡紫拟青霉（PL-HN-16）所产的角蛋白酶活性较高，具有强二硫键还原酶活性，对羽毛降解效果较理想，底物范围较广泛，而其本身又非致病菌，且对营养要求不高，因此淡紫拟青霉在羽毛角蛋白降解中具有一定的潜在应用价值。角蛋白酶能够首先打开底物的二硫键，使角蛋白的高级结构被破坏，将角蛋白解聚变成单体并进一步将其变为纤丝；尽管培养液中的蛋白质总浓度不变，但角蛋白解聚后，培养液中的丝蛋白浓度变大，导致培养液出现胨状物；而后在复合蛋白酶的作用下，将丝蛋白进一步水解为多肽、寡肽和游离氨基酸，这样就会增加其溶解度，最终呈现液化状态。但由于角蛋白的降解机制非常复杂，淡紫拟青霉角蛋白酶的作用机理尚待进一步研究[12]。黄林等研究表明，角蛋白酶是一种复合酶，其中含有特异裂解二硫键的二硫键还原酶和使多肽水解的多肽水解酶。其降解过程为，二硫键还原酶作用于角蛋白二硫键，将胱氨酸还原为半胱氨酸，使角蛋白高级结构解体而形成变性角蛋白，变性角蛋白在多肽水解酶作用下逐渐水解成多肽、寡肽和游离氨基酸，由转氨基作用产生氨气和硫化物而使角蛋白彻底水解。在角蛋白降解过程中，角蛋白中的硫主要转化成巯基化合物、硫化氢和硫酸盐3种含硫化合物存在于分解产物中[13]。酵母菌发酵后的饲料营养丰富，含有多种维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和氨基酸，适口性极好，是集营养与保健为一体的生物活性添加剂[14]。酵母本身也是一种饲料蛋白，其粗蛋白质含量很高，其含量可达干物质的50%，从而使单细胞蛋白饲料在畜牧业被广泛应用[15-16]。

培养基中未添加羽毛粉时，仅由麸皮为双菌的生长繁殖提供必需的营养物质。双菌发酵初期出现颉颃效应，有限的资源使淡紫拟青霉的生长受到限制。随着发酵的进行，在酵母菌的作用下，麸皮中营养性有机物转化为蛋白质资源[10]，为双菌的生长补充氮源，也为淡紫拟青霉的生长提供更好的环境。淡紫拟青霉在发酵过程中可生产出活性较高的角蛋白酶，对羽毛粉起降解作用[17]。以麸皮和羽毛粉作为培养基的营养物质，共同培养酵母菌与淡紫拟青霉。发酵初期，由于竞争作用，双菌的生长状况均优于单一菌培养。随着发酵的进行，氮源等代谢产物富集，碳源、氧气等营养物质的消耗，双菌的生长速度开始低于单一菌培养的速度。从生长曲线来看，酵母菌与淡紫拟青霉之间有一定的竞争性颉颃效应。淡紫拟青霉发酵羽毛粉时，产出游离氨基酸等有机氮源的同时也会产出氨气等无机氮源。与酵母菌共同培养，酵母菌可以消耗部分无机氮源[18]。同时发酵麸皮，起到改善气味、增加蛋白质的作用。从发酵产物来看，酵母菌与淡紫拟青霉之间存在一定的互补协同效应。

4 结论

本试验对酵母菌与淡紫拟青霉混菌固态发酵的条件进行探究，得出麸皮与羽毛粉的配比为7∶3，底物与水比为1∶1时，淡紫拟青霉与酵母菌共同作用更有利于将难消化的羽毛角蛋白质转化成更易吸收的优质饲料蛋白质，为我国饲料蛋白质资源的开发利用提供可行性方法。

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Producing Feed Protein with Feather Degradation Fermented in a Solid State by Mixed Cultures

YANG Ting,LIAO Meide*,HE Yuguang,LIU Sijia,ZHENG Dankeng

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

This study took yeast and Paecilomyces lilacinus as mixed fungus,feather and wheat bran as mixed substrate to carry on solid state fermentation,explored the effects of fermentation conditions of substrate moisture,pro⁃portion of feather and wheat bran on fermentation products.The results showed that wheat bran∶water=1∶1 was most suitable for the growth of yeast;1∶0.8 was most suitable for the grawth of Paecilomyces lilacinus.With 1∶1 water mate⁃rial ratio,when wheat bran∶feather7∶3,it was most suitable for the growth of yeast;when wheat bran∶feather=6∶4,it was most suitable for the growth of Paecilomyces lilacinus.In conclusion,the optimum raw material fermentation condi⁃tionsaresubstratemoisture1∶1andwheatbran∶feather=7∶3.

yeast;Paecilomyces lilacinus;solid state fermentation;feather;feed protein

S816.48

A

1001-0084（2014）12-0001-05

2014-10-30

广州市科技局项目（2008J1-C221）

杨婷（1990-），女，湖北孝感人，硕士研究生，研究方向为微生物发酵及其代谢产物。

*通讯作者：副教授，硕士生导师，E-mail:meideliaotg@163.com