埃博拉病毒感染及其实验室检查

林迪，孙长贵

(解放军第117医院检验科南京军区医学检验质控中心，浙江杭州310013)

·述评·

埃博拉病毒感染及其实验室检查

林迪，孙长贵

(解放军第117医院检验科南京军区医学检验质控中心，浙江杭州310013)

据世界卫生组织官方报道，截至2014年8月4日埃博拉病毒累计感染1 711人，并致932人死亡。埃博拉病毒是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，该病毒致死率极高，为50%～90%。本文就该病毒的结构、生物学特性、流行病学、临床表现、诊断与鉴别诊断和实验室检查等作简要综述。

埃博拉病毒；出血热；流行病学；感染

埃博拉病毒(Ebola virus)感染人类和非人类的灵长类动物(NHPs)会引起病毒性出血热、以发热为特征的急性系统性疾病、凝血障碍、暴发性休克和死亡[1]。2014西非埃博拉病毒疫情于2014年2月首次爆发于几内亚境内，随后迅速蔓延，这次疫情中死亡人数已经超过了过去37年的总和，并有失控情况。由于埃博拉病毒的自然宿主至今尚未确定，针对埃博拉病毒感染尚无疫苗、药物可以预防或治疗，虽然一些研究的疗法可以减轻埃博拉病毒感染的影响，但目前还没有FDA批准的用于暴露后人类使用的治疗方法[2]。所以疫情控制都集中于对病毒感染者进行维持疗法，将他们隔离以限制疫情蔓延。本文就埃博拉病毒相关的结构和生物学特性、发病机制、流行病学、临床表现、诊断与鉴别诊断和实验室检查等作简要综述。

1 埃博拉病毒的结构和生物学特性

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)属丝状病毒科，为不分节段的单股负链RNA病毒，一般呈长丝状体，有时也可能出现“U”字、“6”字形、缠绕、环状或分枝型，其长度约为19 kb，含有7个基因，依次编码核蛋白(NP)、病毒蛋白35(VP35)、病毒蛋白40(VP40)、糖蛋白(GP)、病毒蛋白30(VP30)、病毒蛋白24(VP24)和RNA聚合酶(L)[3]。NP主要为核衣壳蛋白质；VP30和VP35功能尚不明确，但通过与MBV比较表明，它可能参与基因复制和基因表达调节；VP40是一种基质蛋白，参与膜成分和NP的相互作用[4]；GP是通过转录编辑链接的两个开放读码框ORF1和ORF2编码，与毒力蛋白结构密切相关；VP24是一种小的膜蛋白，与毒力蛋白结构有关；L蛋白是一种RNA依赖的RNA聚合酶。目前，根据发源地和抗原特性可将埃博拉病毒分为五个亚型：扎伊尔型(ZEBOV)、苏丹型(SEBOV)、莱斯顿型(REBOV)、科特迪瓦型(CEBOV)和本迪布焦型(BEBOV)，除莱斯顿型对人不致病外，其余四种亚型感染后均可导致人发病。其中ZEBOV和SEBOV对人具有致命性。

埃博拉病毒在常温下较稳定，对热有中等度抵抗力，56℃不能完全灭活，60℃1h方能破坏其感染性；紫外线照射2min可使之完全灭活；对化学药品敏感，乙醚、去氧胆酸钠、β-丙内酯、福尔马林、次氯酸钠等消毒剂可以完全灭活病毒感染性；钴60照射、γ射线也可使之灭活。EBOV在血液样本或病尸中可存活数周；4℃条件下存放5周其感染性保持不变，8周滴度降至一半。-70℃条件可长期保存。

2 发病机制

一些相关研究认为埃博拉病毒感染以炎症介质的上调为主要特点，如细胞因子、趋化因子、干扰素诱导蛋白和肿瘤坏死因子α(TNF-α，促进细胞凋亡，引发炎症，阻止病毒复制，被认为和埃博拉病毒型出血热的高致死率有非常高的联系)[5-10]；此外，跨膜糖蛋白在埃博拉病毒感染中扮演者重要角色，主要发病机理见图1[11]。

3 流行病学

1976年埃博拉病毒首次爆发于苏丹南部和扎伊尔(即现在的刚果埃博拉河地区)，到目前为止埃博拉病毒呈现明显的地方间歇性流行，局限在非洲扎伊尔、苏丹、乌干达、加蓬、南非等地区[12-14]，非洲以外地区偶有病例报道，但均属于输入性或实验室意外感染。该病毒季节性分布不十分明显，也尚无资料表明不同性别间存在发病差异。2014年新爆发于几内亚的西非埃博拉病毒疫情，经德国汉堡Bernhard Nocht热带医学研究所的Stephan Gunther博士等人通过完整基因组测序和系统进化分析发现，来自几内亚的埃博拉病毒为新型埃博拉病毒株，它形成一个独立的分支，与目前已知的来自刚果民主共和国和加蓬的埃博拉病毒株并列，由同一祖先平行演变而来[15]。该病毒早期确诊病例的病死率为86%，临床疑似病例的病死率为71%，这与先前的EBOV爆发的病死率一致[16-18]。

图1 埃博拉病毒感染主要发病机理示意图

据世界卫生组织官方报道，截至2014年8月4日埃博拉病毒累计感染1711人，并致932人死亡。其中几内亚感染495例(351例确诊病例,133例可能病例，11例疑似病例)，死亡363人；利比里亚感染516例(143例确诊病例,252例可能病例，121例疑似病例)死亡282人；尼日利亚感染9例(0例确诊病例，2例可能病例,7例疑似病例),死亡1例；塞拉利昂感染691例(576例确诊病例，49例可能病例，66例疑似病例)死亡286人。

3.1 传染源和宿主动物感染埃博拉病毒的人和非人灵长类动物为本病传染源。虽然到目前病毒还尚未分离到，但狐蝠科的果蝠很有可能是埃博拉病毒的天然宿主，尤其是锤头果蝠、无尾肩章果蝠和小领果蝠[19]。

3.2 传播途径直接接触感染者和被感染动物的血液、分泌物、排泄物或其他体液，病毒也可经黏膜和破损的皮肤进行传播；医务人员在治疗、护理病人或处理病人尸体过程中如没穿戴合适的个人防护设备，也可能会接触到病毒。

3.3 高危人群医务人员、与病人有密切接触的家庭成员或其他人、在葬礼过程中直接接触死者尸体的人员和在雨林地区接触了森林中死亡动物的人等。

4 临床表现和病理特点

本病潜伏期为2～21d，典型病例为急性起病，高热、畏寒、头痛、肌痛、恶心、结膜充血及相对缓脉。随后可出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、黏液便或血便、皮疹等表现。重症患者可出现神志改变，如嗜睡、谵妄等症状。并可出现不同程度的出血表现，包括鼻、口腔、结膜、胃肠道、阴道、皮肤出血或咯血、血尿等，可出现低血压、休克等。可并发心肌炎、肺炎和其它多脏器受损。

主要病理改变是皮肤、黏膜、脏器的出血，多器官可以见到灶性坏死。肝细胞点、灶样坏死是本病的典型特点，可见小包含体和凋亡小体。

5 诊断与鉴别诊断[20,21]

5.1 诊断根据流行病学史、临床表现和实验室检查结果，可做出埃博拉病毒感染的诊断。

5.1.1 流行病学史来自于疫区，或3周内有疫区旅行史，或有与病人、感染动物接触史。

5.1.2 诊断标准

5.1.2.1 疑似病例具有上述流行病学史和临床表现。

5.1.2.2 可能病例指经临床医生评估的任何疑似病例或无法收集标本进行实验室确认，并拥有与确诊病例相关的流行病学特征的任何已故疑似病例。

5.1.2.3 确诊病例疑似病例基础上具备实验室检查任一项检查阳性者。实验室检查阳性者包括：病毒抗原阳性、血清特异性IgM抗体阳性、恢复期血清特异性IgG抗体滴度比急性期有4倍以上增高、患者标本中检出埃博拉病毒RNA及患者标本中分离到埃博拉病毒。

5.2 鉴别诊断应与马尔堡出血热、克里米亚刚果出血热、拉沙热和肾综合征出血热等病毒性出血热，伤寒、恶性疟疾、病毒性肝炎、钩端螺旋体病和斑疹伤寒等疾病鉴别。鉴别诊断主要依靠病原学检查。

6 实验室检查

6.1 一般检查可见白细胞和血小板减少、凝血酶原时间延长和转氨酶升高(AST＞ALT)，有时可见血清淀粉酶升高，早期可有蛋白尿。

6.2 病原学及相关检查

6.2.1 电镜检查电镜直接观察标本培养物上清液中的病毒粒子，根据病毒粒子的大小、形状及粒子内的核衣壳鉴定是否为埃博拉病毒。

6.2.2 病毒抗原检测由于埃博拉出血热有高滴度病毒血症，可采用ELISA等方法检测血标本中病毒抗原。一般发病后2～3周内，可在患者血标本中检测到病毒特异性抗原。

6.2.3 病毒核酸检测对于埃博拉病毒检测目前主要通过逆转录PCR方法检测病毒RNA。一般发病后2周内可从病人血标本中检测到病毒核酸，发病后1周内的标本检出率高。目前已有文献报道使用Real-time PCR检测埃博拉病毒，该方法检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99，灵敏度可达1.0×101拷贝/μl，Realtime PCR检测的敏感度较普通PCR提高106～l07倍，7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性[3]，其快速、灵敏、特异以及较好的重复性为埃博拉病毒的快速检测奠定了基础。Real-time PCR检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒引物和探针序列见表1[3]。Real-time PCR反应体系为25μl，包括：2×预混合液(Premix Ex TaqTM，含有酶、dNTP和Mg2+等成分)12.5μl，ZEBOV或SEBOV上、下游引物各0.5μl (10nmol/L)，探针0.5μl(10nmol/L)，模板1.0μl，用灭菌蒸馏水补足到25μl，混合后进行PCR扩增，扩增条件：95℃，预变性60s；95℃，变性5s；60℃，退火/延伸30s，45个循环。见表1。

表1 Real-time PCR引物和探针序列

6.2.4 病毒分离采集急性发热期患者血标本，用Vero、Hela等细胞进行病毒分离培养，一般发病1周内血标本病毒分离率高。

6.2.5 血清学检测据文献报道，最早可从发病后2d的患者血清中检出特异性IgM抗体，IgM抗体可维持数月。发病后7～10d可检出IgG抗体，IgG抗体可维持数年。多数患者抗体出现于起病后10～14d，也有重症病人始终未能检出抗体。间隔1周及以上的两份血标本IgM抗体阳转或IgG抗体滴度4倍及以上升高具有诊断意义。血清特异性IgM抗体多采用IgM捕捉ELISA法检测[22,23]；血清特异性IgG抗体多采用ELISA、免疫荧光等方法检测。

7 结束语

因为埃博拉病毒的高致死率，加上目前尚未有任何疫苗被证实有效，WHO将埃博拉病毒列为生物安全四级病原菌，并被视为潜在的生物战剂之一。对于埃博拉病毒美国传染病专家海曼也做出这样的描述:埃博拉病毒是人类迄今为止未能征服的致命杀手，是世界医学界面对的一道难以解读的“哥德巴赫猜想”。因此，只有深入研究埃博拉病毒的感染机制，才能有利于埃博拉病毒疫苗和药物的研发。目前，美国国立卫生研究院免疫学家安东尼-弗契带领的研究小组最新研制出一种可以预防埃博拉病毒感染的疫苗，并实验证实对猴子完全有效，预计将于今年9月份对人类进行临床测试。成功研发疫苗并临床应用是预防和控制埃博拉病毒感染与传播的有效手段。

[1]Feldmann H,Geisbert TW.Ebola haemorrhagic fever[J].Lancet, 2011,377(9768):849-862.

[2]Garamszegi S,Yen JY,Honko AN,et al.Transcriptional correlates of disease outcome in anticoagulant-treated non-human primates infected with ebolavirus[J].PLoS Negl Trop Dis,2014,8(7):e3061.

[3]盖微微,郑学星,薛向红,等.埃博拉病毒检测与分型Real-time PCR方法的建立[J].中国病原生物学杂志,2013,8(9):208-211.

[4]Geisbert TW,Jahrling PB.Differentiation of filoviruses by electron microscopy[J].Virus Res,1995,39(2-3):129-150.

[5]Villinger F,Rollin PE,Brar SS,et al.Markedly elevated levels of interferon(IFN)-gamma,IFN-alpha,interleukin(IL)-2,IL-10,and tumor necrosis factor-alpha associated with fatal Ebola virus infection[J].J Infect Dis,1999,179(Suppl 1):188-191.

[6]Gupta M,Mahanty S,Ahmed R,et al.Monocyte-derived human macrophages and peripheral blood mononuclear cells infected with ebola virus secrete MIP-1alpha and TNF-alpha and inhibit poly-IC-induced IFN-alpha in vitro[J].Virology,2001,284(1):20-25.

[7]Hensley LE,Young HA,Jahrling PB,et al.Proinflammatory response during Ebola virus infection of primate models:possible involvement of the tumor necrosis factor receptor superfamily[J].Immunol Lett,2002,80(3):169-179.

[8]Rubins KH,Hensley LE,Wahl-Jensen V,et al.The temporal program of peripheral blood gene expression in the response of nonhuman primates to Ebola hemorrhagic fever[J].Genome Biol,2007,8(8):174.

[9]Yen JY,Garamszegi S,Geisbert JB,et al.Therapeutics of Ebola hemorrhagic fever:whole-genome transcriptional analysis of successful disease mitigation[J].J Infect Dis,2011,204(Suppl 3):1043-1052.

[10]McElroy AK,Erickson BR,Flietstra TD,et al.Ebola hemorrhagic Fever:novel biomarker correlates of clinical outcome[J].J Infect Dis, 2014,210(4):558-566.

[11]Sullivan N,Yang ZY,Nabel GJ.Ebola virus pathogenesis:implications for vaccines and therapies[J].J Virol,2003 77(18):9733-9737.

[12]Peters CJ,LeDuc JW.An introduction to Ebola:the virus and the disease[J].J Infect Dis,1999,179(Suppl 1):ix-xvi.

[13]Colebunders R,Borchert M.Ebola haemorrhagic fever-a review[J]. J Infect,2000,40(1):16-20.

[14]Pourrut X,Kumulungui B,Wittmann T,et al.The natural history of Ebola virus in Africa[J].Microbes Infect,2005,7(7-8):1005-1014.

[15]Baize S,Pannetier D,Oestereich L,et al.Emergence of Zaire Ebola Virus Disease in Guinea-Preliminary Report[J].N Engl J Med, 2014,DOI:10.1056/NEJMoa1404505.

[16]WHO.Ebola haemorrhagic fever in Zaire,1976[J].Bull World Health Organ,1978,56(2):271-293.

[17]Khan AS,Tshioko FK,Heymann DL,et al.The reemergence of Ebola hemorrhagicfever,DemocraticRepublicoftheCongo,1995. Commission de Lutte contre les Epidemies a Kikwit[J].J Infect Dis, 1999.179(Suppl 1):76-86.

[18]Kortepeter MG,Bausch DG,Bray M.Basic clinical and laboratory features of filoviral hemorrhagic fever[J].J InfectDis,2011,204(Suppl 3):810-816.

[19]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.埃博拉出血热防控方案[S].2014.

[20]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.埃博拉诊疗方案[S].2014.

[21]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.六种烈性传染病的预防控制指南和临床诊疗方案[S].2008.

[22]Bermejo M,Rodriguez-Teijeiro JD,Illera G,et al.Ebola outbreak killed 5000 gorillas[J].Science,2006,314(5805):1564.

[23]Zhai J,Palacios G,Towner JS,et al.Rapid molecular strategy for filovirus detection and characterization[J].J Clin Microbiol,2007,45 (1):224-246.

R373.9

A

1674-1129(2014)05-0495-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.05.001

2014-08-12；

2014-08-28)

林迪，女，生于1987年10月，本科，技师，从事临床微生物学检验。

孙长贵，男，生于1962年9月，硕士研究生导师，主任技师，教授。