藤梨根含药血清对鸡胚尿囊膜微血管生长的影响❋

吴秋玲,刘竺华,李朝喧,周晓丽

(1．山西中医学院，太原 030024； 2.山西省中医院，太原 030001)

长期以来,肿瘤一直是危害人类健康的重要杀手，而其中大多数患者均死于肿瘤的浸润和转移。临床上如何防止肿瘤的浸润转移，是肿瘤防治的重要环节。“肿瘤生长依赖血管生成”假说的提出，使抗血管生成的研究得到广泛关注，目前国内外众多学者把研究的重点转移到从中药中筛选抑制肿瘤新生血管的药物。藤梨根为猕猴桃科猕猴桃，属软枣猕猴桃的根，性酸、涩、凉，具有清热解毒、消肿疥、祛风除湿、利尿止血的功效，临床广泛用于抗肿瘤治疗，常与野葡萄藤、半枝莲、半边莲、白茅根等配伍使用于各种癌症,尤对消化道肿瘤胃癌、肠癌等疗效显著。

本实验采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)技术和计算机图像分析技术，观察中药藤梨根含药血清对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响，以衡量中药藤梨根抑制或诱生新血管生成的能力，探讨藤梨根抗肿瘤的作用机制，为临床中药治疗肿瘤并防止肿瘤转移提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新鲜白皮种蛋，表面清洁,每枚重50 g～60 g， 蛋壳均质，受精率>95%，购自山西农科院养殖场。8周龄Wistar大鼠12只，雌雄各半，体质量(190±20) g，购自山西医科大学实验动物中心。

1.1.2 实验仪器 电热恒温孵育箱，DHP-9162上海-恒科技有限公司；超净工作台， 上海巴艾贝斯；倒置荧光显微镜图像采集处理系统；医用图像分析仪，Image-Pro，美国；解剖显微镜，德国Leica公司；眼科剪、眼科镊，上海医疗器械公司。

1.1.3 主要实验药品 藤梨根由山西省中医院中药房提供，经专家鉴定质量符合实验要求。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备 (1)藤梨根浓缩液的制备：取藤梨根120 g，按常规中草药煎煮方法，煎煮提取浓缩至60 ml，得含相当于藤梨根生药2 g/ml的浓缩液，冷却保存备用；(2)动物选择与分组：清洁级Wistar大鼠12只，雌雄各半，随机数字表法分为高剂量组、低剂量组、血清组(阴性对照组)，每组4只；(3)给药方法：藤梨根制成水煎浓缩液，剂量参考李振光报道的给药剂量[1]。高剂量为临床成人(体质量60 kg)剂量的20倍，低剂量为临床成人(体质量60 kg)剂量的10倍，换算得出大鼠每100 g体质量每天给藤梨根高剂量为3.125 ml藤梨根浓缩液(即6.25 g)，低剂量组减半。血清组给予每天2 ml生理盐水。大鼠每天2次灌胃给药,连续给药1周；(4)含药血清的制备：第7天于灌胃给药2 h后，以10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血5 ml离心，吸取透明上清液，分离血清、灭活、除菌,试管分装，-40 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 CAM模型的制备 (1)种蛋表面依次以温水(30～38 ℃)和1∶1000新洁尔灭液溶液消毒后开始孵育。种蛋孵育于有通气孔且温度设置为38.4 ℃的培养箱中(湿度在65～75%)，4 d后温度设置为38.2 ℃。每天转蛋4～5次，并检查胚胎发育情况，及时淘汰发育不良的种蛋；(2)于第2～10天在照卵灯指示下寻找胚头，确定鸡胚绒毛尿囊膜位置。酒精消毒开窗位置，用牙科钻在气室顶端打1 mm～2 mm小孔并穿透气室壳膜，在距胚头前0.5 cm，两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位用笔标记出面积2 cm×1.5 cm区域,用牙科钻在表面轻轻磨切出凹痕,无菌生理盐水消毒，用眼科镊平行向上轻揭凹陷处蛋皮，轻撕内壳膜暴露CAM，制成假气室。以灭菌透明胶膜封闭假气室，形成透明观察窗。解剖显微镜下观察并原位摄影。

1.2.3 藤梨根对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响 (1)于孵育第6天，在检卵灯下观测并标记气室及鸡胚位置，同上述方法制成假气室。显微镜下观察并记录；(2)给药方法:制备假气室之后，用眼科镊将无菌明胶海绵小块(3 mm×3 mm×3 mm)置于藤梨根含药血清中，充分饱和后，放置于距离胚头0.5 cm处两条卵黄静脉之间的相对少血管区，无菌透明胶膜封贴，38.2 ℃孵育48 h；(3)观察方法:孵育48 h后剥离假气室周围的蛋壳，使尿囊膜充分暴露，解剖显微镜下记录血管图像；(4)检测指标:将录制好的图像调入图像分析软件，参考文献计数方法，以明胶海绵为中心选取相同面积的4个区域，应用医用图像处理软件测出所选区域的血管数量和血管面积。

2 结果

2.1 藤梨根高低剂量组对CAM血管生成数量的影响

表1显示,我们之前的实验结果提示，4至6 d鸡胚对于研究观察血管生成情况最理想，但4～5 d的鸡胚生命力弱、死亡率较高。 6 d鸡胚血管网初步形成，可观察到数量较多的小血管及分支，较适宜观察药物对血管生成影响的研究，因此选择6 d鸡胚进行观察研究。实验结果显示，藤梨根高剂量组与空白组、血清组相比较，有较明显的抑制新血管生成能力，藤梨根低剂量组与空白组比较有一定的抑制作用但不显著(P<0.01)。

2.2 藤梨根高低剂量组对CAM血管面积影响

表1显示，藤梨根高低剂量组具有一定抑制血管生成面积的作用，但差异无统计学意义，血清组和空白组之间比较差异无统计学意义。

3 讨论

恶性肿瘤被古代医家归属于为积聚、石瘕、癥瘕等范畴。《诸病源候论》指出:“积聚者由于阴阳不和，脏腑虚弱，受之于风邪，搏于脏腑之气所谓也。” 《中藏经》中指出，癌瘤等“之所作也，皆五脏六腑蓄毒不流则生矣，非独因荣卫壅塞而发者也”。认为脏腑“蓄毒不流”是这类难治性疾病的病机本质，而瘀血留于局部，即恶血，日久可腐变或溃烂成毒，故又有“瘀毒”之说。《圣济总录》中有“毒热内壅，则变为瘀血”的说法。清代医家王清任进一步分析：“蕴毒在内，烧炼其血，血受炼烧，其血必凝”，遂成毒瘀。《仁斋直指附遗方》指出：“癌者，上高下深，岩穴之状，颗粒累垂，毒根深藏。”同样提出了“毒根深藏”是癌瘤难治的关键。有学者认为这“深藏”的毒根，就是存在于肿瘤内生长迅速的功能性血管，而这些血管供应着丰富的血液，促使肿瘤快速增殖。故目前许多专家认为，肿瘤治疗当采用清热解毒、活血化瘀等方法。藤梨根具有清热解毒、祛风除湿的功效，临床广泛用于抗肿瘤治疗，尤对消化道肿瘤如胃癌、肠癌等疗效显著。在前期小鼠体内抗肿瘤转移的预实验中我们发现，藤梨根作用后瘤体缩小，显微镜下观察瘤体内血管减少，由此推测抑制血管生成可能是其抗肿瘤的机制之一，因此我们通过观察藤梨根对CAM血管形成的影响，进一步探讨藤梨根抑制肿瘤的机理。

表1 藤梨根含药血清对CAM血管生成的影响

注：与空白组比较:*P<0.05，**P<0.01，与血清组比较:△P<0.05，△△P<0.01，用药组等剂量比较：▲▲P<0.01

血管生成模型的建立是肿瘤抗血管生成研究必须的关键性步骤。自Folkman[2]提出抗血管生成理论至今,对肿瘤血管形成的机制和抗血管生成药物筛选等方面的研究已取得较大进展。大量的血管生成模型已建立,体外模型如内皮细胞的增殖、迁移和小管形成以及组织模型；体内模型如动物角膜或虹膜内肿瘤移植模型、皮下气囊模型、颅窗软脑膜血管模型、兔耳廓和皮肤内移植模型等。鸡胚绒毛尿囊膜模型相比其他模型具有一定的优势,如鸡胚发育初期血管与肿瘤细胞的新生血管相似, 均表现为内皮细胞胞浆少，线粒体丰富，毛细血管缺少外周细胞；而且作为一种天然的免疫缺陷宿主，鸡胚可接受癌细胞接种和组织的移植；CAM技术较简便，能耐受一定范围的温度变化，且价格低廉,故被广泛采用。本实验结果为中药藤梨根临床抗肿瘤提供实验依据，值得在此基础上进一步深入研究，如对肿瘤血管内皮细胞凋亡情况和VEGF的表达情况等进行研究，揭示中药抗肿瘤的机理，为临床治疗肿瘤寻找副作用小的高效中药。

[1] 李振光,王净净.关于中药血清药理学方法的思考[J].中国中医药信息杂志,2002,9(2):5.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis, therapeutic implications[J]. N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.