择时服用扶正祛邪抗癌方对小鼠化疗造血功能的影响❋

顾检波,王 秀,李 艳

(1.江苏省常熟市支塘人民医院，江苏 常州 215500； 2.皖南医学院，安徽 芜湖 241002；3.皖南医学院附属戈矶山医院，安徽 芜湖 241001)

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，早期患者大多无明显临床症状，70%以上出现症状就诊的患者已属疾病晚期，致使肺癌患者5年生存率低[1，2]。对于肺癌患者，化疗和放疗是主要的治疗手段，但相应治疗也会对人体产生极大的副作用，严重影响患者的生存质量。目前，增效减毒已成为肿瘤学研究的热点，中医药在此方面发挥着重要独特的作用。

“扶正祛邪”法是中医治疗疾病的常用方法，本文所用的扶正祛邪抗癌方为国医大师李济仁教授及李艳主任医师治疗晚期肺癌临床医案及相关用药经验中精简化裁出的经验方，在前期的临床观察中取得了较好的疗效。“择时服用”是李济仁教授传承自新安医学的独特经验，为观察扶正祛邪抗癌方选择不同时间给药的治疗效果。本实验在lewis肺癌荷瘤小鼠模型上进行实验研究，观察该方对小鼠化疗造血功能的影响以及择时用药对机体造血水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及瘤株

SPF级雄性C57BL/6近交小鼠60只，4～6周龄，体质量18～22 g，购于南京青龙山实验动物中心，由扬州大学比较医学中心提供(合格证号SCXK(苏)2012～0004)。Lewis肺癌瘤株种鼠由皖南医学院中心实验室提供。

1.2 试验药物及试剂

中药扶正祛邪抗癌方由黄芪、当归、党参、石见穿、白花蛇舌草按7∶3∶3∶2∶2组成，购置于皖南医学院弋矶山医院药房。采用浸泡、煮沸、水浴浓缩等方法制备，生药含量为1 g/ml，按常人剂量(10 g/60 kg)灌服。P4394-顺铂由上海前尘生物科技有限公司提供，用生理盐水配置成浓度为0.25 mg/ml的溶液待用。粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素含量采用双抗体夹心ELISA法检测，试剂盒由武汉贝茵莱生物科技有限公司提供。ELx800全自动酶联仪购自美国宝特仪器有限公司。

1.3 造模及分组

雄性C57BL/6近交小鼠60只，适应性喂养1周后进行造模。方法为取传代14 d的荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠，脱颈椎处死，放入75%酒精中浸泡消毒10 min，在无菌条件下剥取肿瘤组织，剔除坏死部分和纤维组织置于无菌器皿中。将瘤组织剪成碎片，于组织研磨器中加入4 ml生理盐水轻轻研磨成组织匀浆液，200目细胞筛过滤，制成单细胞悬液，台盼蓝染色，光镜下计数活细胞数，用生理盐水调整细胞浓度约为1×107/ml。用1 ml的注射器取上述悬液0.2 ml，于空白组外每只小鼠右前肢腋内皮下接种。造模后按体质量随机分成空白组、模型组、化疗组、辰时中药+化疗组(简称辰时组)、午时中药+化疗组(简称午时组)、亥时中药+化疗组(简称亥时组)6组，每组10只。

1.4 给药时间及给药方法

于腋下造模第5天确认造模成功后开始给药。空白组不做任何处理，各时辰组灌胃扶正祛邪抗癌方每天1次并腹腔注射顺铂化疗隔天1次，化疗组腹腔每天上午9∶00注射顺铂化疗隔天1次并每天灌胃等量生理盐水，对照组采取等量生理盐水灌胃以及腹腔注射持续2周。中药择时灌胃取时为常人早、中、晚(睡前)服药时间，分别对应十二时辰中辰时(胃经旺时：7∶00-9∶00)、午时(心经旺时：11∶00-13∶00)、亥时(三焦经旺时：21∶00-23∶00)。

1.5 标本制备及指标检测

各组小鼠用药结束后第2天开始收集标本，摘眼球取血收集血标本，分别装入加EDTA抗凝管中及2 mlEP管中。其中2 mlEP管中血液在冷藏15 min后给予离心机3000 r/min，离心15 min取上层血清，-20 ℃冰箱保存待测。而EDTA抗凝管中血液迅速用于红细胞和白细胞计数。处死小鼠后进行骨髓标本制备，来源于小鼠完整左侧股骨，制备的骨髓细胞液放入5 mlEP管中待测。小鼠血清粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)含量测定严格按照说明书操作。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般状况影响

本次实验小鼠60只，死亡2只，为模型组、化疗组各死亡1只。实验初，各组小鼠进食、饮水、活动等一般状况差异无统计学意义。造模后第5天，除空白组外各组小鼠腋下均可及直径约2～5 mm硬结，成瘤率100%。随着用药时间的推移和肿瘤的增长，模型组、化疗组、各时辰用药组小鼠进食、进水、清理皮毛等活动均有减少，小鼠精神萎靡，被毛无光，喜欢群聚。而空白组小鼠进食、饮水等一般状况无明显改变。

2.2 小鼠外周血白细胞和红细胞比较

表1显示，与模型组比较，化疗组及辰时组、午时组的白细胞和红细胞明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与化疗组比较，各时辰用药组的白细胞计数有所回升，差异有统计学意义(P<0.05)。与午时组比较，亥时组的白细胞计数回升较明显，差异有统计学意义(P<0.05)，而红细胞计数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各实验组小鼠外周血白细胞和红细胞计数比较

注：与模型组比较：★P<0.05；与化疗组比较：△P<0.05，与午时组比较：○P<0.05

2.3 小鼠骨髓有核细胞比较

表2显示，与模型组比较，化疗组及辰时组、午时组、亥时组的骨髓有核细胞计数明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。化疗组骨髓有核细胞计数下降均最为明显，与化疗组比较，各时辰组均有不同回升，差异有统计学意义(P<0.05)。与辰时组及午时组比较，亥时组骨髓有核细胞计数回升较明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各实验组小鼠骨髓有核细胞计数比较

注：与模型组比较：★P<0.05；与化疗组比较：△P<0.05，与午时组比较：○P<0.05

2.4 小鼠血清EPO、G-CSF含量比较

表3显示，各实验组小鼠血清EPO、G-CSF含量均出现不同程度下降，与模型组比较，化疗组血清EPO、G-CSF含量下降最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。与化疗组比较，亥时组血清EPO、G-CSF含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。而各时辰用药组血清EPO、G-CSF含量均出现不同程度回升，与辰时组比较，亥时组血清G-CSF含量回升较明显，差异有统计学意义(P<0.05)，而亥时组血清EPO含量差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各实验组小鼠血清G-CSF、EPO含量比较

注：与模型组比较：P<0.05；与化疗组比较：△P<0.05，与辰时组比较：○P<0.05

3 讨论

中医治疗恶性肿瘤的主要法则是“扶正祛邪化毒”，而肺癌患者本身机体常可出现免疫抑制状态，故在治疗中应增强患者免疫力，提高机体抗肿瘤能力[3，4]。扶正祛邪抗癌方由当归、黄芪、党参、白花蛇舌草、石见穿5味药物组成。方中重用黄芪为君，意在补气生血、实卫固表；用当归、党参为臣，当归补血和营，党参补脾肺气兼而补血，两者配合黄芪气血双补，使补气扶正，气旺血生，阳有所附；白花蛇舌草、石见穿为佐，两药清热解毒、消肿散结，用以消散癌肿，使邪去正安。全方配合使用，适用于治疗晚期肺癌尤其是肺癌化疗后所致虚实夹杂之证。

中医时间医学是国医大师李济仁及其弟子胡建北在国内较早开展的研究项目，并取得了较好的成果。“强调服药时间，注重动静宜忌”；“推崇数方并用，主张定时分服”是其主要学术思想之一。本研究中扶正祛邪抗癌方可减轻化疗所引起的骨髓抑制，表现在各时辰用药组外周血白细胞、红细胞以及骨髓有核细胞数目均出现不同程度回升，表明扶正抗癌祛邪方可以减轻化疗药物所引起的骨髓抑制，对骨髓造血功能具有保护作用。其中亥时用药组中亥时组外周血白细胞、红细胞以及骨髓有核细胞数目回升最为明显，与其他时辰用药组比较差异有统计学意义，表明不同时段服用扶正抗癌祛邪方对小鼠外周血及骨髓造血功能具有不同影响。而针对白细胞、红细胞以及骨髓有核细胞数目回升的不同，考虑与各系细胞增殖周期相关。

血细胞的产生源于骨髓造血干细胞，而一些作用于造血前体细胞的造血生长因子可以促进骨髓造血细胞的增殖和分化，促进各系幼稚细胞成熟，如EPO和G-CSF、GM-CSF、IL-3等。实验发现，一些中草药可以提高人体血清中造血生长因子如EPO、G-CSF等的表达，进而促进骨髓造血。临床常用于骨髓抑制后造血功能修复的中药有黄芪、当归、党参等。黄芪的主要有效成分为黄芪多糖，研究发现黄芪多糖可提升肿瘤患者免疫功能[5]，并能提高患者生活质量，延长生存时间[6]。另有研究发现，黄芪多糖对注射环磷酰胺引起的小鼠骨髓抑制模型的造血功能具有修复作用，黄芪多糖可明显增加实验小鼠骨髓细胞及外周血细胞计数，且存在一定的量效关系[7]。当归多糖对造血功能的亦有不错保护效果[8]。有研究指出，经当归多糖诱导的骨髓巨噬细胞培养后上清液可以提升髓系造血祖细胞集落产生率，其表达的EPO、GM-CSF、IL-3、IL-6蛋白水平均出现不同程度的提高，而EPO mRNA以及GM-CSF mRNA的表达水平明显提高，证明当归多糖可以直接或间接刺激造血，诱导微环境中的骨髓巨噬细胞从基因和蛋白水平上促进造血因子的合成与分泌[9]。有学者认为，当归多糖对造血动员的调控可能与降低造血细胞表面某些黏附分子表达相关[10]。本研究化疗组EPO、G-CSF含量下降，提示化疗可引起造血生长因子EPO、G-CSF表达的降低，而扶正祛邪抗癌方可以影响小鼠血清中EPO、G-CSF的表达，表现为各时辰用药组EPO、G-CSF含量的回升。同时本实验结果还发现，亥时用药组小鼠G-CSF含量回升最明显，表明不同时段用药对机体造血功能产生不同影响，而时间医学在肿瘤治疗中应用的目的就在于使化疗中选择药物对肿瘤细胞杀伤最强而对正常组织损伤最小的时间治疗，以及选择促进化疗后组织恢复的最佳时间进行治疗。我们认为其可能与择时用药促进造血因子的释放，不同时段骨髓造血前体细胞对造血因子的敏感不同相关，其具体机制尚需进一步研究。

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