代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建

张恒丽，蔡 恒， 汪 晨，张 凯，周志惠

(南京工业大学生物与制药工程学院，南京211800)

代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建

张恒丽，蔡 恒， 汪 晨，张 凯，周志惠

(南京工业大学生物与制药工程学院，南京211800)

为了使谷氨酸棒杆菌较好地利用木糖生产有机酸，将来自EscherichiacoliK-12的木糖异构酶基因xylA构建到表达载体pXMJ19中，导入CorynebacteriumglutamicumATCC13032 Δldh中，成功表达了该酶基因。结果表明：重组菌株在以木糖为唯一C源进行发酵时，木糖的消耗速率为0.54 g/(L·h)，木糖异构酶比酶活约为0.54 U/mL；在以木糖和葡萄糖的混合糖为C源进行发酵时，菌株优先利用葡萄糖，在葡萄糖完全消耗后，菌株开始有效利用木糖；以木糖为唯一C源进行两阶段发酵时，琥珀酸的收率可达(0.62±0.003)g/g。

谷氨酸棒杆菌；琥珀酸；木糖异构酶基因；木糖

随着全球经济的高速发展，以石油为主体的化石能源危机正日益严峻，可持续替代资源的开发和利用已成为当务之急。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一，广泛存在于工农业废弃物中，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，利用酸解或酶解的方法可将其转化为还原性糖，产生大量的五碳糖(D-木糖和L-阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)，其中六碳糖约占2/3，五碳糖约占1/3。在半纤维素的水解产物中，D-木糖约占90%[1-3]。

谷氨酸棒杆菌广泛分布在自然界中，是工业生产的优良菌株，对木质纤维素中的抑制物，如4-羟基苯甲酸、香草醛、丁香醛等具有较好的耐受性，在利用木质纤维素降解成分方面具有极大的优势[4-5]。谷氨酸棒杆菌在进行工业生产时通常以葡萄糖、蔗糖等作为底物，由于缺乏转化木糖的酶系而不能有效地利用木糖，但能发酵其异构体木酮糖[6]，而木糖的利用是微生物利用木质纤维素类降解组分生物转化为乙醇、琥珀酸等大宗化学品的一个关键环节，因此构建可以利用木糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株极为重要。当前，日本的RITE研究所对CorynebacteriumglutamicumR木糖的利用进行了研究，实验发现，将大肠杆菌的木糖异构酶和木酮糖激酶基因整合至C.glutamicumR基因组上，可以实现其代谢木糖的能力，在以40 g/L葡萄糖、20 g/LD-木糖和10 g/LD-纤维二糖作为C源时，重组菌株在12 h可以将其完全消耗，且无碳代谢阻遏效应的存在[7]。

笔者以C.glutamicumATCC13032 Δldh为出发菌株，通过克隆E.coliK-12木糖异构酶基因xylA，将其连接于诱导型表达载体pXMJ19上，电转化C.glutamicumATCC13032 Δldh,实现木糖的利用，以期为后续的谷氨酸棒杆菌的进一步构建和改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

CorynebacteriumglutamicumATCC13032 Δldh、E.coliJM109均为笔者所在实验室保藏，质粒pXMJ19由德国科隆大学A Burkovski教授惠赠。

1.2 酶与试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR反应试剂、Prime STAR DNA聚合酶及DNA Marker，均购自大连Takara公司；氯霉素，购自南京生兴生物技术有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，Oxoid公司产品；其余为国产分析纯;引物合成与测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 培养基与培养条件

1.3.1 培养基

培养菌体培养基为LB(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10、pH 7.0，固体培养基再加琼脂20。

电转化所用SOC培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物5，NaCl 0.5，KCl 0.19,MgCl2·6H2O 0.2,葡萄糖3.6。

发酵用BT培养基(g/L)：(NH4)2SO47,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO4·H2O 0.004,生物素 0.000 2，维生素B10.000 2。

发酵用A培养基(g/L)：尿素 2，酵母粉 2，酪蛋白氨基酸 7，(NH4)2SO47,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO4·H2O 0.004,生物素 0.000 2，维生素B10.000 2。

大肠杆菌培养用抗生素质量浓度为50 μg/mL，谷氨酸棒杆菌培养用抗生素质量浓度为10 μg/mL 。

1.3.2 培养条件

1)种子培养条件 在平板中将一环菌接入至装有50 mL培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、200 r/min培养12 h。

2)有氧培养条件 将种子液按5%的比例接种到装有100 mL培养基的500 mL锥形瓶中，30 ℃、200 r/min培养。

3)厌氧培养条件 将有氧培养后的菌液室温8 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌水洗涤2次后用少量厌氧培养基重悬菌泥，并接入装有50 mL培养基的血清瓶中，通入CO2气体1 min，确保血清瓶中为厌氧环境，30 ℃、150 r/min条件下厌氧发酵18 h。

1.4 目的基因的克隆

DNA酶切、连接、转化和大肠杆菌感受态制备等基本基因操作技术参照文献[8]及有关公司提供的操作手册进行，电转化感受态细胞制备参照文献[9]。基因组DNA提取采用天根生化科技有限公司的试剂盒，PCR反应采用Biometra公司PCR仪，电转化采用Bio-Rad公司高压脉冲电击转化仪。

1.5 目的基因xylA的克隆

参照NCBI数据库中已公布的E.coliK-12xylA基因序列，分别设计含有Hind III和XbaI酶切位点及其保护碱基的上下游引物。F：5′-GATAAGCTTACCTGATTATGGAGTTCAAT-3′，下划线部分为引入的Hind III酶切位点；R：5′-GATTCTAGACATATCGATCGTTCCTTAAA-3′，下划线部分为引入的XbaI酶切位点。

以E.coliK-12基因组DNA为模板，采用Prime STAR DNA 聚合酶进行PCR扩增，50 μL体积反应体系为：上下游引物(100 pmol/μL)各2 μL；模板DNA 0.5 μL；5×Prime buffer 10 μL；dNTP 4 μL；Prime STAR 0.5 μL；双蒸水33 μL。

PCR循环参数为：预变性95 ℃，5 min；(95 ℃，1 min，56 ℃，15 s，72 ℃，2 min)，30个循环；72 ℃，10 min。

1.6 谷氨酸棒杆菌中木糖代谢途径的构建

将纯化的PCR产物和pXMJ19质粒分别使用Hind III和XbaI双酶切后进行连接、转化，通过酶切鉴定阳性克隆子，命名为pXMJ19-xylA。将pXMJ19-xylA电转化到C.glutamicumATCC13032 Δldh中，经氯霉素抗性平板筛选后，提取质粒进行PCR和酶切鉴定阳性重组子，命名为C.glutamicumNC-2。

1.7 木糖异构酶的活性检测

1.7.1 粗酶液的制备

取5 mL菌液于4 ℃、5 000 r/min离心10 min收集菌体，用无菌水洗涤2次后，菌体重悬于1 mL PBS(pH 7.2)缓冲液，于冰浴中超声破碎细胞，离心取上清液即为粗酶液。

1.7.2 酶活力的测定

酶活力测定采用半胱氨酸-咔唑法[10]。PBS缓冲液(pH 7.2)50 μL ，0.1 molD-木糖50 μL，10 mmol/L MnCl250 μL于50 ℃反应1 h后，沸水浴终止反应；取50 μL立即加入1.5%的半胱氨酸盐酸盐0.2 mL，13 mol/L的H2SO46 mL，混匀，25 ℃反应30 min后于540 nm处测定光吸收，根据木酮糖标准曲线求得木酮糖含量。

在标准反应混合物中，酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生1 μmol 木酮糖所需的酶量。

1.8 分析方法

1.8.1 菌体密度的测定

采用UV-3000扫描型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司 )于600 nm 处测定吸光值OD600。

1.8.2 糖浓度的测定

葡萄糖浓度采用SBA 240C型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定，木糖浓度测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[11]。

1.8.3 发酵产物的测定

采用HPLC测定发酵产物，色谱条件：美国Alltech公司Prevail Organic Acid色谱柱(250 nm×4.6 mm,5 μm)，柱温 室温，流动相 25 mmol/L KH2PO4、pH 2.5，流速 1 mL/min，进样量 25 μL；检测器为紫外，检测波长 215 nm[12]。

2 结果与讨论

2.1 目的基因xylA的克隆

以E.coliK-12基因组为模板，PCR扩增的产物通过琼脂糖凝胶电泳分析显示，所克隆片段大小约为1.4 kb(图1)，与预期片段大小一致，经过测序分析，与Genebank中已知基因序列一致。

M—λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1—PCR product图1 木糖异构酶基因(xylA)PCR扩增产物Fig.1 PCR product of xylA gene

2.2 重组菌株C.glutamicum NC-2的构建

将酶切后的xylA片段和载体pXMJ19进行连接，转化感受态E.coliJM109，经氯霉素抗性平板筛选，提取质粒通过EcoRI单酶切验证，通过琼脂糖凝胶电泳分析显示，酶切后的片段大小约为8 kb，与预期结果一致，结果见图2。将该重组质粒电转化到C.glutamicumATCC13032 Δldh中，经氯霉素抗性筛选，提取质粒进行EcoR I单酶切鉴定，获得重组菌株C.glutamicumNC-2。

2.3 重组菌株C.glutamicum NC-2对木糖的利用

在添加20 g/L木糖或者葡萄糖的BT发酵培养基中，30 ℃、200 r/min有氧培养24 h,考察重组菌株C.glutamicumNC-2对木糖的利用情况，并与利用葡萄糖的情况进行比较，结果见图3。

M—λ-EcoT14 I digest DNA Marker;1—pXMJ19-xylA(+)/EcoR I图2 表达重组子pXMJ19(+)-xylA的酶切鉴定Fig.2 EcoRI digest of recombinant plasmid pXMJ19-xylA(+)

图3 C.glutamicum ATCC13032 Δldh和 C.glutamicum NC-2利用葡萄糖或 木糖的生长情况Fig.3 Growth of C. glutamicum ATCC13032 Δldh and C. glutamicum NC-2 strain in mineral medium containing either glucose or xylose

由图3可知：在好氧条件下，重组菌株C.glutamicumNC-2与对照菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh利用葡萄糖的生长情况大致相同，但是在以木糖为唯一C源的培养基中生长时，对照菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh不能有效地利用木糖生长，而重组菌株C.glutamicumNC-2经过24 h的培养后其菌体生长量超过其利用葡萄糖的菌体水平，木糖的消耗速率达到0.54 g/(L·h)，略低于葡萄糖(0.62 g/(L·h))，经检测重组菌木糖异构酶比酶活约为0.54 U/mL。表明xylA的基因表达使菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh具有利用木糖生长的能力，拓宽了其底物利用范围。

2.4 重组菌株C.glutamicum NC-2利用混合糖的生长情况

在添加12 g/L木糖和14 g/L葡萄糖的BT发酵培养基中，30 ℃、200 r/min有氧培养36 h,考察重组菌株C.glutamicumNC-2利用混合糖的生长情况，结果如图4所示。

由图4可知：在混合糖发酵过程中，重组菌株首先利用葡萄糖，在发酵24 h时，葡萄糖几乎被消耗完，而木糖为9.8 g/L，仅消耗了15%，发酵至36 h时，60%的木糖被利用，该结果表明，由于碳代谢阻遏效应的存在[13-14]，菌株不能够同时对葡萄糖和木糖进行利用。

图4 C.glutamicum NC-2利用混合糖的生长情况Fig.4 Growth of C.glutamicum NC-2 strain in mineral medium containing mixed sugar

2.5 重组菌株C.glutamicum NC-2的两阶段发酵情况

为了考察重组菌株利用木糖生产有机酸的情况，本研究采用两阶段发酵模式，即利用添加20 g/L木糖的100 mL A培养基，30 ℃、200 r/min培养18 h进行好氧发酵，然后通过添加40 g/L木糖的50 mL BT培养基，30 ℃、150 r/min培养18 h进行厌氧发酵产酸，结果如表1所示。

由表1可知：对照菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh不能够以木糖作为唯一C源生产有机酸，而重组菌株C.glutamicumNC-2在厌氧条件下发酵18 h内，可消耗(26.0±0.08)g/L木糖，发酵产物主要是琥珀酸，其收率可达到(0.62±0.003)g/g，与对照菌株相同条件下消耗葡萄糖发酵结果大致相同。

在谷氨酸棒杆菌中，运输己糖主要通过磷酸转移酶系统[15]，但是机制尚不清楚，对于其他革兰氏阳性菌中戊糖转运的机制已有报道[16]：比如，突变的枯草芽胞杆菌通过AraE蛋白运输木糖，自身的H+同向运输载体负责阿拉伯糖的转运[17]；几种重组的酿酒酵母菌株通过非特异性的单糖运输系统吸收木糖，但是对木糖的亲和力比葡萄糖低将近200倍[18]。本研究则通过表达xylA基因实现了谷氨酸棒杆菌对木糖的利用，表明在谷氨酸棒杆菌中存在与木糖吸收有关的运输载体。

表1 菌株两阶段发酵结果Table 1 Results of two-stage fermentation

3 结 论

以拓宽谷氨酸棒杆菌底物利用谱进行有机酸发酵为目标，将E.colixylA基因成功构建到诱导型表达载体pXMJ19，酶活测定证明转入C.glutamicumATCC13032 Δldh中的酶基因得到了活性表达。实验表明，该工程菌株C.glutamicumNC-2可以在木糖为唯一C源的培养基中进行生长，培养24 h后的菌体生长量与利用葡萄糖的菌体水平基本相同，木糖的消耗速率达到0.54 g/(L·h),与葡萄糖消耗速率相比略低。在添加葡萄糖和木糖的BT培养基中发酵时，重组菌优先利用葡萄糖，在葡萄糖完全消耗后开始有效利用木糖，以木糖为唯一C源进行两阶段发酵时，产物主要为琥珀酸，收率为(0.62±0.003)g/g。木糖异构酶对于木糖利用起着极为重要的作用。

[1] Gong C S,Cao N J,Du J,et al.Ethanol production from renewable resource[J].Adv Biocehm Eng/Biotechnol,1999,65:207-241.

[2] 张颖,马瑞强,洪浩舟,等.重组运动发酵单胞菌的构建及木糖利用特性研究[J].生物技术通报,2009(7):160-165.

[3] Kawaguchi H,Sasaki M,Vertès A A,et al.Engineering of anL-arabinose metabolic pathway inCorynebacteriumglutamicum[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,77(5):1053-1062.

[4] Cheung S W,Anderson B C.Laboratory investigation of ethanol production from municipal primary waste water solids[J].Bioresour Technol,1997,59:81-96.

[5] Sakai S,Tsuchida Y,Okion S,et al.Effect of lignocellulose-derived inhibitors on growth of and ethanol production by growth-arrestedCorynebacteriumglutamicumR[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(7):2349-2353.

[6] Blombach B,Seibold G M.Carbohydrate metabolism inCorynebacteriumglutamicumand applications for the metabolic engineering ofL-lysine production strains[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,86(5):1313-1322.

[7] Sasaki M,Jojima T,Inui M,et al.Simultaneous utilization ofD-cellobiose,D-glucose,andD-xylose by recombinantCorynebacteriumglutamicumunder oxygen-deprived conditions[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,81(4):691-699.

[8] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].3版.北京:科学出版社,2002.

[9] 余秉琦，沈徽，诸葛健.适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法[J].中国生物工程杂志,2005,25(2):78-81.

[10] Dische Z,Borenfreund E.A new spectrophotometric method for the detection anddetermination of keto sugars and trioses[J].J Biol Chem,1951,912:583-587.

[11] 宁正祥.食品成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社,1998.

[12] Liu R,Liang L,Chen K,et al.Fermentation of xylose to succinate by enhancement of ATP supply in metabolically engineeredEscherichiacoli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,94(4):959-968.

[13] Magasanik B.Catabolite repression[J].Cold Spring Harbor Symp Quant Biol,1961,26:249-256.

[14] Deutscher J.The mechanisms of carbon catabolite repression in bacteria[J].Curr Opin Microbiol,2008,11(2):87-93.

[15] Kotrba P,Inui M,Yukawa H.TheptsI gene encoding enzyme I of the phosphotransferase system ofCorynebacteriumglutamicum[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,289:1307-1313.

[16] Stülke J,Hillen W.Regulation of carbon catabolism inBacillusspecies[J].Annu Rev Microbiol,2000,54:849-880.

[17] Krispin O,Allmansberger R.TheBacillussubtilisAraE protein displays a broad substrate specificity for several different sugars[J].J Bacteriol,1998,180:3250-3252.

[18] Hamacher T,Becher J,Gárdonyi M,et al.Characterization of the xylose-transporting properties of yeast hexose transporters and their influence on xylose utilization[J].Microbiol,2002，148:2783-2788.

(责任编辑 荀志金)

Construction of xylose-utilizing recombinant Corynebacterium glutamicum strain

ZHANG Hengli,CAI Heng,WANG Chen,ZHANG Kai,ZHOU Zhihui

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

In order to construct a strain ofCorynebacteriumglutamicumby using the xylose to produce organic acids,thexylAgene fromEscherichiacoliK-12,encoding xylose isomerase,was integrated in the expression vector of pXMJ19.The gene was expressed in theCorynebacteriumglutamicumATCC13032 Δldhstrain.The recombinant strain was capable of growth on xylose as a sole carbon source,the xylose consumption rate was 0.54 g/(L·h).The xylose isomerase activity reached 0.54 U/mL.In medium containing glucose and xylose,the recombinant strain consumed glucose first，after the glucose was consumped entirely,the effective utilization of xylose was started.The yield of succinate was (0.62±0.003) g/g during the two-stage fermentation on xylose as a sole carbon source.

Corynebacteriumglutamicum;succinic acid;xylA;xylose

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.006

2012-10-30

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2011CB707405)

张恒丽(1985—)，女，河北邢台人，硕士研究生，研究方向：微生物学，基因工程；蔡 恒(联系人)，副教授，E-mail:cheng@njtech.edu.cn

Q786

A

1672-3678(2014)02-0028-05