Ag-SiO2核壳型纳米粒的制备及其抗菌作用

陆 露，郑丽屏，赵培飞，王剑文

(1.苏州大学 医学部 药学院，苏州 215123;2.苏州大学 金螳螂建筑与城市环境学院，苏州 215123;3.云南省农业科学院 园艺作物研究所，昆明 650205)

金属-无机纳米核壳复合材料因同时具有纳米粒径和复合组分，被广泛应用于传感器、催化、信息存储、抗体检测、涂料、农业及植物研究等领域［1-3］。通过制备Ag-SiO2核-壳型纳米粒，可以在提高核心农药物质稳定性的同时，发挥缓释核心物质的效果［4］。Ag-SiO2核壳型纳米粒以 SiO2壳层包裹 Ag+，可有效屏蔽内核Ag+的相互作用，得到单分散的核壳颗粒，其外层SiO2具有良好的生物相容性和多孔结构，保持了Ag+的化学活性和催化活性。同时，细菌对 Ag+不易产生耐药性［5］，是一种长效抗菌剂［6］。Kim 等［7］于2007 年发现 Ag-SiO2核壳型纳米粒具有较好的抑制细菌生长作用。Zheng等［8］的研究表明:Ag-SiO2核壳型纳米粒对6种植物病原真菌具有强烈的抑制作用，但有关Ag-SiO2核壳型纳米粒抗病原真菌的过程和机制研究则少见报道。

香石竹枯萎病是由镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi，race 2)侵染所致的土传病害，是对香石竹最严重的病害之一，在世界各香石竹种植区均有发生［9］。此病在我国各香石竹种植区亦有普遍发生，危害较重，昆明地区一般发病率为10% ～30%，重者达70% ～80%［10］，因此，亟须应用新的防治方法。笔者在前期研究的基础上，采用改进的Stöber法制备 Ag-SiO2复合纳米颗粒［11］，并对复合纳米颗粒结构进行了表征，研究Ag-SiO2纳米悬浮液对镰刀菌菌丝、孢子生长的抑制及对真菌抗氧化酶的影响，初步探讨了Ag-SiO2核壳型纳米粒的抑菌机制，以期为Ag-SiO2核壳型纳米粒的抗菌应用，以及为香石竹枯萎病的防治提供纳米抗菌技术的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

香石竹镰刀菌2号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi，race 2)由云南省农业科学院园艺研究所提供。

1.2 试验材料及培养基

真菌培养均采用马铃薯固体培养基(简称PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(简称 PD)。AgNO3、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、氨水、乙醇与正硅酸四乙酯等均为国产分析纯。

1.3 Ag-SiO2纳米粒的制备

Ag-SiO2纳米粒的制备参考文献［11］的方法，略作修改。将0.145 g CTAB溶于180 mL去离子水，加热并磁力搅拌使其充分溶解，加入0.1 mol/L的AgNO3溶液10 mL，于5 min内加入5 mmol/L抗坏血酸溶液10 mL，继续搅拌30 min，加入30%(体积分数)氨水至pH约为6。加入50 mL无水乙醇与1 mL正硅酸四乙酯，室温继续搅拌4 h。将产物经中速定性滤纸过滤，去离子水与无水乙醇洗涤，经121℃、25 min高压蒸气灭菌后，置于烘箱100℃烘干。

1.4 纳米粒的分析与表征

采用日本Shimadzu公司UV2401-PC紫外-可见分光光度计在波长300～500 nm范围内扫描，通过观察银的特征吸收峰变化来判断反应过程中的具体变化。采用荷兰 Philips-FEI公司 XL30 ESEMTMP环境扫描电镜观察Ag-SiO2纳米粒的形貌、尺寸及分散情况;采用美国PSS公司的380ZLS型粒径和电位分析仪测定粒径大小。

1.5 抑菌作用的测定

采用杯碟法测定Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌的抑制作用［12］。将Ag-SiO2纳米粒用PD液体培养基分别稀释成 0、2、4、8、16、32、64 和 128 μg/mL，备用。取15 mL灭菌后的PDA培养基置于直径9 cm培养皿中，作为下层培养基，再将10 mL含有105个/mL镰刀菌的PDA培养基均匀覆盖在冷却后的下层PDA培养基上，静置冷却1 h。而后在每块平板上放置4个牛津杯(直径0.6 cm，高1.0 cm)，分别向每个牛津杯内加入100 μL不同浓度Ag-SiO2纳米粒悬浮液，水平放置直到液体完全渗透到培养基中。将处理后的平板置于(28±1)℃培养箱中，以PD液体培养基为对照，培养3 d后观察抑菌效果。

1.6 菌丝和孢子生长的显微观察

取15 mL灭菌后的PDA培养基置于9 cm培养皿中，作为下层培养基。将10 mL含有105个/mL镰刀菌的PDA培养基均匀覆盖在冷却后的下层PDA培养基上，静置冷却1 h。而后在每块平板上放置4个牛津杯，分别加入100 μL用PD液体培养基稀释的Ag-SiO2纳米粒(32 μg/mL)和 PD 液体培养基，水平放置直到液体完全渗透到培养基中。将处理后的平板置于(28±1)℃培养箱中，每个处理3次重复。培养3 d后，在体视显微镜下观察菌丝形态，研究Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌菌丝生长的影响。

采用凹玻片水滴法观察Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌孢子生长的影响，吸取100 μL孢子悬浮液以及100 μL纳米银溶液混匀后，滴在载玻片上，加盖盖玻片，置于带湿海绵的培养皿内，将培养皿放入(28±1)℃培养箱内暗培养，分别于48、96 h后在倒置显微镜下镜检孢子的生长发育情况。

1.7 菌体蛋白含量及抗氧化相关酶活性的测定

在PDA平板中接种镰刀菌，培养3 d后，用打孔器打取直径4 mm的菌碟，转接到PDA液体培养基中，静置培养5 d后，取出长好的镰刀菌菌丝体，用蒸馏水冲洗3次后用吸水纸吸干，准确称取质量0.25 g菌丝，分别放入100 mL纳米银(32 μg/mL)溶液和蒸馏水对照溶液中浸泡2、4、10和20 h，菌丝体过滤取出后用蒸馏水冲洗3次后用吸水纸吸干，加入0.86%生理盐水3 mL在冰浴下研磨，3000 r/min离心15 min，取上清液，置于4℃冰箱保存，待用。待测液蛋白质含量通过 Bradford法［13］测定。蛋白质含量标准曲线利用不同浓度牛血清白蛋白标准溶液绘制。超氧化物歧化酶活力采用NBT法测定［14］。过氧化氢酶酶活力测定参照文献［15］的方法，过氧化物酶活力测定参照文献［16］的方法。

2 结果与讨论

2.1 Ag-SiO2纳米粒的制备及表征分析

对Ag-SiO2纳米粒形成过程进行了紫外光谱分析，如图1(a)所示。由图1(a)可知，随着抗坏血酸的加入，410 nm附近逐渐出现吸收峰，为单质Ag+的特征吸收峰［17］。说明随着反应的进行有Ag+被还原出来。而随后检测发现，在410 nm附近Ag+特征吸收峰存在一定的红移，从408 nm处到414 nm，提示Ag+纳米粒逐渐被SiO2外壳所包覆，这与参考文献［11］报道一致。而环境扫描电镜显示(图1(b))纳米粒为近似球形，粒径约为100 nm。为进一步确定Ag-SiO2纳米粒的平均粒径，试样经乙醇分散，去离子水稀释后通过激光粒度仪测定(图1(c))，3次重复实验结果显示所制备纳米粒平均粒径为92.9 nm。

图1 Ag-SiO2纳米粒的表征Fig.1 Characterization of Ag-SiO2nanoparticles

2.2 对镰刀菌的生长抑制作用

图2为Ag-SiO2纳米溶液对镰刀菌的生长抑制实验结果。由图2可知，在抑菌圈试验中，Ag-SiO2纳米溶液对镰刀菌表现出良好的抑制作用，最低抑菌质量浓度(MIC)为4 μg/mL，且抑制效果随浓度增大而增强，在32 μg/mL条件下，其抑制效果最好。在后续实验中以此浓度进一步实验。

图3为Ag-SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌菌丝生长形态的影响结果。由图3可知:在32 μg/mL Ag-SiO2纳米粒作用下，镰刀菌菌丝体的生长呈现异常状态，菌丝较细、分支减少、欲折、透明度差，而对照菌丝生长正常、粗细均匀、分支较多、透明度较大。由此可知，Ag-SiO2纳米粒可能会促使镰刀菌畸变，使其无法正常生长，失去侵染植物能力。

图2 Ag-SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌的生长抑制影响Fig.2 Effects of the Ag-SiO2nanoparticles on growth inhibition of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi

图3 Ag-SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌菌丝生长形态的影响Fig.3 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on mycelia growth of Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi

以不同浓度Ag-SiO2纳米粒处理镰刀菌孢子，在24、72 h对孢子形态结构进行了观察，结果如图4所示。由图4可知:在对照条件下，一个产孢细胞上可相继形成多个产孢位点，每个产孢位点以吹泡式产生全壁芽殖式分生孢子。且随着纳米银浓度的加大，产孢位点逐渐减少，并不能正常分生出小孢子。后续实验观察到，在高浓度纳米银处理组(128 μg/mL)作用下，菌丝已经无法分生出孢子。

图4 Ag-SiO2纳米粒浓度对香石竹镰刀菌孢子形态的影响Fig.4 Effects of Ag-SiO2nanoparticles concertration on spore morphology of Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi

2.3 Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白含量的影响

考察Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白含量的影响，结果见图5。由图5可知:经32 μg/mL Ag-SiO2纳米粒处理后，发现镰刀菌菌体的可溶性蛋白含量变化范围较小，处理4 h后，菌体中可溶性蛋白含量比对照升高了8.50%，而处理20 h则比对照降低了1.47%。这与孙冬梅等［18］报道的纳米银对大豆菌核病核盘菌的抑制中可溶性蛋白变化相一致，而一些研究者也发现某些抑菌剂能抑制菌体蛋白质的合成［19］，推测Ag-SiO2纳米粒对菌体的抑制并非通过抑制蛋白质的合成而起作用。

图5 Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白的影响Fig.5 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on mycelium protein content of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi

2.4 Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌抗氧化酶活性的影响

图6为Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌抗氧化酶活性的影响结果。由图6可知:经Ag-SiO2纳米粒处理后，镰刀菌菌体的总超氧化物歧化酶(SOD)活性增加，处理4 h后比对照组活性升高了28.14%，说明过氧化氢酶(CAT)在活性氧代谢中发挥重要的作用，是清除H2O2的主要酶类。菌丝处理2、4 h后，菌体过氧化氢酶活性分别比对照升高了48.18%、37.09%，而处理10、20 h比对照降低了15.00%、46.93%。Ag-SiO2纳米粒处理后镰刀菌菌体过氧化物酶(POD)活性变化较大，处理2、4、10 h分别比对照升高170.42%、98.68%、36.69%。处理20 h比对照降低了47.16%。

3 结论

本文以AgNO3作为Ag+来源，利用抗坏血酸对其进行还原生成银纳米粒核心;利用正硅酸四乙酯的水解与聚合反应获得SiO2，使其包裹在银核心外形成介孔外壳，最终制备Ag-SiO2核壳型纳米粒，平均粒径约为92.9 nm，发现可以有效地抑制香石竹镰刀菌的生长，且最小抑菌质量浓度为4 μg/mL。

图6 Ag-SiO2纳米粒对镰刀菌总SOD、CAT和POD活性的影响Fig.6 Effects of Ag-SiO2nanoparticles on SOD(a)，CAT(b)and POD(c)activity of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi mycelium

进一步实验结果表明:Ag-SiO2核壳型纳米粒可能通过真菌中活性氧的诱导产生，导致菌丝生长畸形、孢子分生困难，从而抑制真菌的生长。随着纳米银材料在医药领域上的广泛应用，纳米银的制备，抗菌和抗肿瘤机制被越来越深入地探讨，但在农业上的应用还少见报道，本研究为其在植物病原真菌防治上的应用提供了Ag-SiO2核壳型纳米粒合成的方法，该方法简单有效且低成本。由此可见深入了解纳米银的抗菌机制，对于实现及农业应用也非常重要。

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