沙柳原料高浓度底物酶解发酵乙醇工艺

林增祥，李荣秀，刘 莉，沈兆兵，史吉平

(1.中国科学院上海高等研究院可持续技术研究中心，上海201210；2.上海交通大学生命科学技术学院生物制造实验室，上海200240)

沙柳原料高浓度底物酶解发酵乙醇工艺

林增祥1,2，李荣秀2，刘 莉1，沈兆兵1，史吉平1

(1.中国科学院上海高等研究院可持续技术研究中心，上海201210；2.上海交通大学生命科学技术学院生物制造实验室，上海200240)

为了提高沙柳生物转化过程的经济可行性，考察了沙柳原料经过蒸爆、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱预处理后高浓度底物补料酶解的效果，并对其高浓度水解糖液进行了乙醇发酵。结果表明：蒸爆处理法水解效果最好，通过补料酶解，底物质量分数可以达到30%，酶解液中总糖质量浓度达到132 g/L，葡萄糖质量浓度105 g/L； 超微粉碎+稀酸预处理原料底物质量分数可以达到22%，酶解液中总糖质量浓度达到123 g/L，葡萄糖质量浓度73 g/L；超微粉碎+稀碱预处理原料底物质量分数可以达到22%，酶解液中总糖质量浓度133 g/L，葡萄糖质量浓度77 g/L。3种预处理使沙柳原料的酶解糖液都可以较好地被酿酒酵母利用发酵产乙醇，蒸爆处理原料的酶解糖液乙醇发酵效果最好，乙醇质量浓度达到47 g/L。

乙醇；发酵；高浓酶解；预处理；沙柳

沙柳(Salixpsammophila)是一种常见的沙生灌木，具有良好的防风固沙、保持水土、改善生态的特性，广泛生长在内蒙古、青海、甘肃、新疆等地区。沙柳平均3～4年平茬一次，平茬以后可继续茂盛生长，否则会自然衰败枯死。目前，平茬下来的枝条除少部分被用来造纸及生产人造板外[1]，大部分未被充分利用。

沙柳可以作为纤维素乙醇等生化产品潜在的木质纤维原料，其生物转化过程主要有3个环节：首先是对沙柳进行预处理，其次是将原料中的纤维素、半纤维素水解为可发酵的糖，最后是以水解糖液利用酵母菌发酵产乙醇。由于木质纤维素内部致密复杂的天然结构及纤维素结晶的特点，阻碍了纤维素酶对纤维素的水解，因此需要采用合适的预处理方法，以提高纤维素的酶水解效率。原料经过预处理过程可以实现木质纤维素原料的组分分离和结构改变，从而进一步提高酶水解效率[2-4]。近年来,研究应用较多的木质纤维原料预处理方法中主要有蒸气爆破预处理、稀酸预处理和稀碱预处理等。虽然科研人员对木质纤维素的预处理方法进行了大量研究，但是针对沙柳原料的预处理及高浓度底物酶解发酵的研究仍相对比较少[5-9]。

纤维素乙醇原料的酶解过程广泛采用提高底物浓度的方法，以提高纤维素乙醇生产工艺的经济性。这样不仅可以提高原料水解液的糖浓度，还可以提高发酵液中乙醇的浓度。这样就可以减小设备的规模,降低乙醇浓缩时的能耗以及整个工艺过程的水耗。但是如果纤维素酶水解时的初始干物质含量高于15%，整个反应体系基本以湿的固体物料的形态存在，会严重影响酶解过程的传质和传热问题，大大降低酶解反应的速率，不利于酶解反应进行。通过分批补料酶解工艺是解决这一难题的重要方法。

本研究以经过蒸爆、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱3种预处理的沙柳枝条为原料，在高浓度底物条件下对原料酶解发酵效果进行考察，以期为沙柳原料的低成本、高效率的生物转化，同时对我国沙化土地治理模式、促进沙地生态能源林基地建设提供参考[10-11]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1)原料 沙柳(产地：内蒙古鄂尔多斯，水份含量5.5%)；

2)纤维素酶制剂 纤维素酶(上海尤特尔生化有限公司，滤纸酶活：346 FPU/g)；

3)酿酒酵母 超级酿酒高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；

4)原料预处理设备 QBS-80型汽爆工艺试验台(河南鹤壁市正道重机集团有限公司)，超微气流粉碎机(上海高等研究院微纳粉体设备研发实验室)。

1.2 沙柳原料的预处理

根据本实验室前期的研究基础，确定了沙柳原料的蒸气爆破预处理、超微粉碎+稀酸预处理、超微粉碎+稀碱预处理的最优条件如下[12-14]：

1)超微粉碎+稀碱处理 超微粉碎原料粒度(15 μm)、NaOH 0.8%(质量体积比)、95 ℃、45 min。

2)超微粉碎+稀酸处理 超微粉碎原料粒度(15 μm)、固液比1∶12(g/mL)、温度160 ℃、H2SO40.5%、时间20 min。

3)蒸气爆破预处理 蒸爆处理条件为压力3.5 MPa、维压时间300 s。

将经过预处理的沙柳原料用自来水冲洗，纱布过滤，取滤渣自然晾干，然后用自封塑料袋封装储藏。

1.3 预处理沙柳原料的酶解

1) 批式酶解 蒸气爆破预处理、超微粉碎+稀酸预处理、超微粉碎+稀碱预处理的沙柳原料，各准确称取12.0 g(干质量)，加入0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，1 g底物纤维素酶加量为20 FPU，酶解体系底物质量分数为12%，三角摇瓶酶解，酶解糖化条件为：pH 4.8、恒温摇床转速250 r/min、温度50 ℃、酶解72 h后，酶解液离心，取上清液测定酶解液中糖浓度，沙柳原料酶解率(Y)按下式(1)计算。

(1)

式中：m1为酶解液中还原糖质量,g；m2为底物中纤维素质量，g；m3为底物中半纤维素质量,g。

2)补料酶解 酶解初始底物浓度为12%，酶解糖化条件同上。在酶解24 h后补料，蒸爆处理原料最终底物质量分数达到30%，酶加量分别达到30、40和60 FPU/g底物；稀酸、稀碱处理底物达到22%，酶加量分别达到30、40和60 FPU/g底物，补料酶解96 h后，取酶解样液分析总糖浓度与葡萄糖浓度。

1.4 酶解液的乙醇发酵

取50 mL补料酶解得到的沙柳酶解液，装入100 mL三角瓶中，添加安琪酵母粉4.0 g/L，于37 ℃、摇床转速100 r/min，发酵60 h后取发酵液，离心，取上清液检测分析。

1.5 分析方法

1.5.1 水解液中葡萄糖含量的分析

利用山东省科学院生物研究所SBA-40D型生物传感分析仪测定。

1.5.2 水解液中总还原糖含量的分析

采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定[15]。

1.5.3 发酵液中乙醇含量的分析

采用气相色谱(GC)法测定乙醇含量[16]。

2 结果与讨论

2.1 预处理方法对沙柳原料组分的影响

图1 预处理方法对沙柳原料中纤维素与 半纤维素含量的影响Fig.1 Effects of pretreatment methods on cellulose and hemicelluloses components in Salix

参照文献[17]的原料分析方法，对不同预处理沙柳原料中纤维素与半纤维素含量进行分析，结果见图1。由图1可以看出：经过预处理后的原料其组分含量发生了较大的变化。超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱处理过程中由于酸碱对原料的水解作用，使得处理后的沙柳原料中半纤维素含量减少，纤维素组分相对不易被水解导致其含量在原料中相对增高。在蒸气爆破过程中，蒸爆处理原料的纤维素和半纤维素组分由于受到高温高压水的作用而发生水解、热降解，导致纤维素和半纤维素含量降低。尤其半纤维素组分在高温长时间的处理过程中大部分发生了自水解和降解，使其在原料处理中含量最低[18-19]。

2.2 预处理方法对酶解的影响

比较经过不同预处理方法的沙柳原料在相同的酶解条件下的水解效果结果见图2。由图2可以看出：蒸气爆破预处理沙柳原料水解效率最高，原料的水解率可以达到93.8%。这是由于沙柳原料经蒸汽爆破预处理后,物料的粒度变小、致密的纤维束相互分开松散、原料比表面积增大、天然纤维的部分结晶结构破坏、物料中半纤维素和部分木质素被降解以及纤维素内部氢键的破坏等，有利于增加纤维素酶的可及度，从而提高了纤维素酶的水解效率和原料的酶水解率[12,20]。

图2 预处理方法对酶解的影响Fig.2 Effects of pretreatment mehods on batch enzymatic hydrolysis of Salix

超微粉碎+稀碱预处理的过程机制与蒸气爆破处理法不同，稀碱处理法利用NaOH中OH-，使木质素的醚键断裂，削弱纤维素、半纤维素的氢键，皂化半纤维素和木质素之间的酯键。随着醚键的减少，部分果胶、木质素和半纤维素等低分子杂质溶解于反应液中，同时纤维素膨胀，半纤维素溶解，原料的空隙率增加。稀碱处理后的原料中纤维素得到润胀，结晶度降低，天然纤维素复杂的刚性结构被破坏，进而提高了超微粉碎沙柳原料的酶解率。超微粉碎+稀酸预处理过程可以将木质纤维素原料中半纤维素水解为木糖，随着半纤维素的水解，原料中纤维素的结晶度降低，原料变得疏松，从而可以增大纤维素与纤维素酶的接触面积，进而提高原料的酶解效率，使预处理原料水解率可以达到70%[13-14，21-22]。

2.3 高浓度底物补料对酶解的影响

为了获得较高的发酵产物浓度，木质纤维素原料在酶解过程中通常采用增大底物浓度的方法。但是较高的初始底物浓度会给原料的水解过程带来严重的传热传质问题，因此为了加快原料的酶水解反应速度以及强化反应过程，通过分批补料的酶解方式可以解决这一难题。

考察经不同预处理法后的沙柳原料在高浓度底物条件下的水解效果，结果见图3。由图3可以看出：蒸爆处理原料的水解效果最好，在30%底物浓度，30 FPU/g底物的条件下，原料的水解率为87%，葡萄糖质量浓度91 g/L；当加酶量为60 FPU/g底物时，原料水解率可以达到最大值，酶解液中葡萄糖质量浓度105 g/L，总糖质量浓度132 g/L。相对来讲，以超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱处理原料时，由于原料无法充分酶解，为湿的物料团块，非流体状态的酶解液，所以当酶加量达到60 FPU/g底物时，酶解体系为较黏稠的流体状态酶解液。在此条件下，超微粉碎+稀酸处理原料水解率为73%，酶解液中葡萄糖质量浓度75 g/L，总糖质量浓度123 g/L。超微粉碎+稀碱处理原料水解率72%，酶解液中葡萄糖质量浓度77 g/L，总糖质量浓度133 g/L。

图3 高浓底物补料对酶解的影响Fig.3 Effects of high solid concentration on enzymatic hydrolysis

2.4 高浓度底物水解液的乙醇发酵结果

通过比较蒸爆、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱预处理原料高浓度底物酶解液的发酵效果，结果见图4。由图4可以看出：蒸爆预处理原料酶解糖液的乙醇发酵效果最好，发酵后的乙醇质量浓度最高可以达到47 g/L。相对来讲，发酵液中残留葡萄糖质量浓度也较高，主要是因为蒸爆处理原料酶解液的发酵体系中固形物含量较高所致，而较高的固形物浓度易导致发酵糖液的流体状态比较黏稠，进而影响了发酵过程的传质效果，使得有部分的葡萄糖残留。相比较而言，超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱处理原料的酶解液中残留的葡萄糖质量浓度较低，这是由于固形物浓度相对较低，因此发酵过程中发酵糖液的黏度也比较小，促进了发酵过程的传质效果，而发酵液中总糖残留较高说明在酵母发酵过程中，酶解液中还有不能被酵母利用的木糖等其他糖成分残留。

图4 沙柳原料水解液乙醇发酵结果Fig.4 Ethanol fermentation results of Salix hydrolyzate

3 结 论

通过对蒸爆预处理、超微粉碎+稀酸预处理、超微粉碎+稀碱预处理沙柳原料在相同酶解条件下的酶水解效果的考察，可以看出蒸气爆破预处理沙柳原料水解效率最高，原料的水解率可以达到93.8%；超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀碱处理法水解效果则相差不大。

通过对高浓度底物补料酶解效果的考察，可以看出蒸气爆破预处理原料水解速度最快，酶解最终底物质量浓度可以达到30%，酶解4 d后酶解液中总糖质量浓度达到132 g/L，葡萄糖质量浓度105 g/L；超微粉碎+稀酸预处理原料底物质量浓度可以达到22%，酶解液中总糖质量浓度123 g/L，葡萄糖质量浓度73 g/L；超微粉碎+稀碱预处理原料底物质量浓度可以达到22%，酶解液中总糖质量浓度133 g/L，葡萄糖质量浓度77 g/L。

通过对酶解液发酵效果的考察可以看出，3种预处理方法所得沙柳水解液都可以较好地被酿酒酵母利用发酵产乙醇，蒸爆预处理的原料酶解液葡萄糖浓度最高，因而发酵液中乙醇含量也最高，可以达到47 g/L。但是发酵液中葡萄糖有残留，利用不充分，主要是因为高固含量的酶解发酵体系影响了发酵过程的传质效果，使得水解液中糖成分不能被充分的利用。因此，为了提高葡萄糖的利用率，后续的研究可以通过改进发酵反应器设计增加传质效果，或者采取固液分离的发酵方法。

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(责任编辑 周晓薇)

Process of high-solid loadings on enzymatic hydrolysis andethanol fermentation of Salix biomass

LIN Zengxiang1,2,LI Rongxiu2,LIU Li1,SHEN Zhaobing1，SHI Jiping1

(1.Research Center for Sustainable Technology,Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201210,China; 2.Key Laboratory of Microbial Metabolism of the Ministry,College of Life Science and Biotechnology,Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China)

In order to improve the economic benefit of theSalixbiorefinery process,this paper examined theSalixpretreatment by steam explosion,ultrafine grinding with dilute acid,ultrafine grinding with dilute alkali,followed by high solid concentration of enzymatic hydrolysis,and ethanol fermentation by yeast.The results showed that steam explosion is the best pretreatment method forSalixenzymatic hydrolysis.The substrate concentration could reach 30% by feeding enzymatic method.The enzymatic hydrolyzate of total sugar concentration was 132 g/L and the glucose was 105 g/L.When using the ultrafine grinding and dilute acid pretreated material,the substrate concentration could reach 22%, the enzymatic hydrolyzate of total sugar concentration was 123 g/L and glucose concentration was 73 g/L.When using the ultrafine grinding and dilute alkali pretreated material,the substrate concentration could reach 22%,the enzymatic hydrolyzate of total sugar concentration was 133 g/L and glucose concentration was 77 g/L.The enzymatic hydrolyzate of three pretreatment methods forSalixcould be fermented to ethanol by yeast and the hydrolyzate of steam explosion pretreated materials could reach 47 g/L ethanol by fermentation.

ethanol;fermentation；high-solid loading hydrolysis；pretreatment；Salix

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.001

2013-01-05

上海市科委项目(10dz1210400)；上海浦东博士后基金(Y234081D01)

林增祥(1980—)，男，新疆博乐人，博士后，研究方向：生物化工；史吉平(联系人)，研究员,E-mail:shijp@sari.ac.cn

S216.2

A

1672-3678(2014)02-0001-05