素食者产雌马酚肠道菌生长条件优化

李笑梅，贾 尧

（哈尔滨商业大学 黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

素食者产雌马酚肠道菌生长条件优化

李笑梅，贾 尧

（哈尔滨商业大学 黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

以菌落数和光密度值以及雌马酚含量为评价指标，测定两株肠道菌的生长曲线，考察金属盐MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3对其生长状况的影响，筛查其对不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖）的利用情况。其次采用单因素试验和正交试验对生长条件进行优化。结果表明：LJ-G1 和LJ-Q2两株菌的生长规律为在37 ℃厌氧条件下，培养6 h后进入指数期、21 h后进入生长平稳期、39 h后为衰亡期。金属盐对菌株生长均有抑制作用，作用最强的为MnSO4；葡萄糖对肠道菌的生长有促进作用。生长最优条件为：培养基中葡萄糖质量浓度7 g/L、pH 7.2、NaCl质量浓度2 g/L，雌马酚的产量较高为11.89 μg/mL。

素食者；肠道菌；雌马酚

雌马酚（equol）是1932年Marrian等[1]在怀孕雌马的尿液中分离羟雌酮时发现的，并确定分子式为C15H14O3。1982年Axelson等[2]在普通人的尿液中发现了雌马酚，还证明人在摄入大豆异黄酮后能在肠道菌的参与下降解产生雌马酚。雌马酚经尿和胆汁排泄，排出浓度存在个体差异，受大豆异黄酮种类、肠道菌群多样性、膳食成分等因素的影响[3-5]，其中主要取决于肠道微生物菌群的组成及代谢能力[6-8]。Kenneth等[9]通过对41 名青年人包括29 名素食者和12 名非素食主义者进行了研究，用质谱方法（mass spectrometer，MS）分析血清和尿液中大豆苷元和雌马酚浓度，发现在素食者中雌马酚产生者为59%，比非素食者高出25%[10-12]。

近些来，对以人粪样为样本分离大豆异黄酮降解菌的研究发展较快，通过对培养条件的优化和控制，获得多种不同代谢特性的厌氧型降解菌，且多为革兰氏阳性杆菌。2007年Uchiyama等[13]成功分离出乳酸球菌20-92、真杆菌7-430和梭菌20-197，能将大豆素（daidzein）直接转化为雌马酚；Jin等[14]在2008年分离得到菌株PUE和DZE，PUE能将葛根素转化为大豆素，DZE能将大豆素和染料木素（genistein）分别转化为Equo和15-OH-equol。Tamura等[15]于2006年分离得到的TM-40菌株，不能直接将大豆素转化为雌马酚，只具有将大豆苷（daidzin）和大豆素转化为双氢大豆素（dihydrodaidzein，DHD）的能力。在前期的研究中，采集了6 位女性素食志愿者的粪样作为样本，从中培养分离出LJ-G1和LJ-Q2两株肠道菌，均为厌氧菌，LJ-G1为革兰氏阴性杆菌，LJ-Q2为革兰氏阳性球菌，纯培养均具有代谢大豆异黄酮产雌马酚的能力[16]。

目前雌马酚的体外获得主要通过两种途径，一是将大豆苷元从大豆中提取出后，在催化剂的作用下还原合成雌马酚，另一种是筛选出雌马酚产生菌，进行体外培养，以大豆苷元为底物，从培养液中得到雌马酚[17-19]。前者成本较高，不利于雌马酚的广泛应用，因此利用微生物发酵法生产雌马酚具有广阔的前景。本研究在前期工作基础上，研究素食者产雌马酚肠道菌生长规律、优化菌株生长条件，为后续菌株降解大豆异黄酮的代谢研究，开发以生物发酵法制备雌马酚提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

菌种：LJ-G1和LJ-Q2由黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室自素食者粪便分离保藏[16]。

大豆异黄酮（纯度80%） 西安市天园生物制药厂；雌马酚标准品（纯度98%） 合肥兰旭生物有限公司；BHI 肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司；琼脂粉 上海山医学化验所试剂厂；乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖 天津市化学试剂一厂；硫酸锰、硫酸锌、氯化钙、碳酸钠、硝酸钾 吉林宏久试剂厂。

1.2 仪器与设备

YQX-Ⅱ型培养箱 上海新苗医疗机械有限公司；超洁净工作台 上海净化设备有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海恒科学仪器有限公司；TU-1900型双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 添加大豆异黄酮培养基制备及菌种活化

本实验所用器皿均在干燥箱内经150 ℃、3 h干热灭菌，液态试剂均在压力蒸汽灭菌器内经102.9 kPa，20 min湿热灭菌，无菌操作在超净工作台下完成。

称取9.5 g BHI肉汤培养基溶于250 mL蒸馏水中，调节pH 7.4，加入质量浓度为5 mg/mL的大豆异黄酮溶液，使其终质量浓度为0.75 mg/mL。取保存于斜面的LJ-G1和LJ-Q2菌株，将供试菌种分别接种于BHI肉汤培养基中，置于37 ℃厌氧培养12 h。取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制菌悬液，采用平板计数法调制菌悬液浓度为106～107CFU/mL，备用[20]。

1.3.2 肠道菌生长曲线的测定

生长曲线的测定采用活菌计数法[21]。将活化后的菌液接种于装有BHI液体培养基的试管中（n=3），接菌量体积分数5%，在48 h内每隔3 h跟踪测定活菌数，并根据这些实验数据绘制生长曲线[22]，进行分析，以便更好的掌握和利用其生长规律。按公式（1）计算菌数。

式中：S为培养基中总活菌数/（CFU/mL）；X1、X2、X3为同一稀释度菌落数/（CFU/mL）；N为菌落稀释倍数。

1.3.3 雌马酚测定方法

雌马酚定量测定采用紫外法[23]，将固体培养基用80%乙醇溶液充分溶解后，活性炭脱色6 h、过滤，用聚酰胺树脂进行纯化，5 h后收集纯化液，以80%乙醇溶液定容，205 nm波长处测定OD值[24]。回归方程为：y=0.174 04x＋0.006 23（R2=0.996 9）。按公式（2）计算培养基中雌马酚含量。

式中：ρ1为培养基中雌马酚质量浓度/（μg/mL）；V1为培养基体积/mL；V2为定容后体积/mL；ρ2为回归方程计算得到的雌马酚质量浓度/（μg/mL）。

1.3.4 不同种类的金属盐及其浓度对肠道菌生长的影响

向BHI液体培养基中分别添加MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3溶液[25]，使其浓度（以培养基体积计）分别达到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，再将活化后的LJ-G1和LJ-Q2的菌液按体积分数5%接种于BHI液体培养基中，37 ℃厌氧培养36 h，以只接菌未添加金属盐的培养基作为对照，BHI液体培养基最大吸收波长为460 nm，因而在此波长处测定光密度（OD）值（n=3），考察各金属盐及不同浓度对肠道菌生长的影响。

1.3.5 不同碳源对肠道菌的影响

选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖5 种碳源，分别添加于BHI培养基中，质量浓度（以培养基体积计）达到10 g/L，以不添加糖为对照。分别接种稀释度为10-5的LJ-G1和LJ-Q2菌液各0.2 mL[16]，倒置放入厌氧箱中，37 ℃培养36 h后，采用活菌计数法计数（n=3）。

1.3.6 生长条件单因素试验

单因素试验主要考虑葡萄糖质量浓度、pH值、NaCl质量浓度这3 个因素，在BHI固体培养基上，基础培养条件为葡萄糖质量浓度（以培养基体积计）7 g/L、pH 7、NaCl质量浓度（以培养基计）4 g/L。接种、培养条件、评价指标按1.3.5节操作，考察各因素适宜范围。

1.3.7 菌株生长条件正交试验

根据单因素试验结果，采用L9（34）进行正交试验，以雌马酚产量为评价指标，优化生长条件。试验中的各组平行试验结果的差异显著性检验均采用常用的统计方法F检验法[26]。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定结果

图1 2 株肠道菌生长曲线Fig.1 Growth curves of two intestinal bacteria

由图1可知，2 株菌0～3 h均显示生长相对迟缓，6～24 h菌株呈指数生长，24～39 h菌数平稳，39 h后活菌数开始减少进入衰亡期。此外图1还显示2 种菌在21 h之前的增殖速率基本相同，但从21 h开始进入生长平稳期间后，LJ-Q2较LJ-G1增殖速率快，39 h后LJ-Q2较LJ-G1衰亡速率快。研究结果对于后续发酵法制备雌马酚有实际参考作用。

2.2 金属盐对肠道菌生长的影响

2.2.1 不同浓度金属盐对LJ-G1肠道菌生长的影响

图2 不同浓度金属盐对LJ-G1肠道菌生长的影响Fig.2 Effect of different concentrations of salts on the growth of LJ-G1

由图2可知，5 种金属盐的不同浓度对LJ-G1菌生长均有不同程度的影响，运用F检验的方法，对各种差异进行统计学分析得知：Na2CO3浓度在0.3 mol/L之前与对照组比其影响无显著差异（P＞0.05），不具有统计学意义，但0.5 mol/L与0.3 mol/L相比呈明显的抑制作用（P＜0.05）；CaCl2浓度0.1 mol/L与0.5 mol/L相比差异显著（P＜0.05），浓度愈大抑制作用愈强，具有统计学意义；KNO3这5 个浓度的影响比较一致；ZnSO4浓度为0.3 mol/L 时抑制作用最小，0.3 mol/L分别与0.1 mol/L和0.5 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义；MnSO4浓度为0.1 mol/L时抑制作用相对较小，与0.5 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义。由图2还可知，与对照组比较，5 种金属盐对LJ-G1菌生长的抑制作用由弱到强依次为Na2CO3＜CaCl2＜KNO3＜ZnSO4＜MnSO4。

2.2.2 不同浓度金属盐对LJ-Q2肠道菌生长的影响

图3 不同浓度金属盐对LJ-Q2肠道菌生长的影响Fig.3 Effect of different concentrations of salts on growth of LJ-Q2

由图3可知，5 种金属盐的不同浓度对LJ-Q2菌生长也均有不同程度的影响。运用F检验的方法，对各种差异进行统计学分析得知：Na2CO3对LJ-Q2菌的影响结果同于LJ-G1菌；CaCl2浓度由0.1～0.3 mol/L抑制作用显著增强（P＜0.05），具有统计学意义；KNO3的影响与CaCl2相似；ZnSO4浓度0.1 mol/L与0.2 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，即浓度在0.2～0.4 mol/L之间抑制作用较小；MnSO4浓度0.1 mol/L与0.2 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，浓度在0.2 mol/L时抑制作用相对较小，其后随浓度增大抑制作用更强。

总体来看，5 种金属盐对2 种产雌马酚肠道菌的生长均有抑制作用，最强的为MnSO4。在菌的培养增殖期间应防止金属污染。

2.3 不同碳源对肠道菌生长的影响

图4 不同碳源对肠道菌生长的影响Fig.4 Effect of different carbon sources on the growth of two intestinal bacteria

由图4可知，5 种糖对两株菌生长促进作用的影响从大到小依次为：葡萄糖＞麦芽糖＞乳糖＞蔗糖＞果糖，与对照组相比葡萄糖最明显，其次是麦芽糖和乳糖。运用F检验的方法，对各种差异进行统计学分析，蔗糖的影响与对照组相比差异不显著（P＞0.05），不具有统计学意义，果糖的影响呈抑制作用与对照组相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，与果糖不易被微生物分解有关，这可能是蔗糖影响作用不明显的缘故。大量体外研究表明，葡萄糖可作为肠道菌的有益碳源，而其他有害菌体不能利用或代谢利用率很低[27]，这一结果可指导在以发酵法制备雌马酚时，添加葡萄糖作为营养物质，使产雌马酚菌增殖提高其产量。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 葡萄糖质量浓度对肠道菌生长的影响

图5 不同葡萄糖质量浓度对肠道菌生长的影响Fig.5 Effect of glucose concentration on the growth of two intestinal bacteria

在pH 7、NaCl质量浓度为4 g/L 时，改变葡萄糖质量浓度分别为1、3、5、7、9 g/L，考察不同葡萄糖质量浓度对肠道菌生长的影响，结果见图5。LJ-G1和LJ-Q2菌株菌落数在葡萄糖质量浓度为1～7 g/L时呈上升趋势，当葡萄糖质量浓度为7 g/L时活菌数量值达到最大，此后随质量浓度增高，活菌落数快速下降，原因是渗透压升高，不利于菌的生长。葡萄糖对LJ-Q2菌的影响高于LJ-G1菌。

2.4.2 pH值对肠道菌生长的影响

图6 pH值对肠道菌生长的影响Fig.6 Effect of pH on the growth of two intestinal bacteria

在葡萄糖质量浓度为7 g/L、NaCl质量浓度为4 g/L时，改变pH值分别为 4、5、6、7、8，考察pH值对肠道菌生长的影响，结果见图6。LJ-G1和LJ-Q2菌落数在pH 4～6时呈上升趋势，在pH值为7时达到最高，之后呈下降趋势，可以判定菌种在pH 7时是菌落的最适生长pH值环境，本结果符合正常人体肠道内为pH 6.8～7.3之间，在此范围选择不同水平进行正交试验。

2.4.3 渗透压对肠道菌生长的影响

图7 NaCl质量浓度对肠道菌生长的影响Fig.7 Effect of NaCl concentration on the growth of two intestinal bacteria

在葡萄糖质量浓度为7 g/L、pH值为7时，改变渗透压（NaCl质量浓度）分别为2、4、6、8、10 g/L，考察渗透压对肠道菌生长的影响，结果见图7。LJ-G1和LJ-Q2活菌数随NaCl质量浓度的升高而增大，NaCl质量浓度为4 g/L时达到最大，超过4 g/L之后活菌数明显呈下降趋势，且下降幅度较大。原因是随NaCl质量浓度的继续增高，会提高环境的渗透压从而使菌不能继续生长，由此可知NaCl适宜质量浓度为4 g/L左右。

从以上试验得到两种肠道菌3个因素最适水平范围一致，故生长条件的优化只选择LJ-Q2菌株进行试验。

2.5 肠道菌生长条件的优化

表1 肠道菌生长条件L9（34）正交试验设计方案及结果Table1 Orthogonal array design L9(34) with observed equol yield for optimization of culture conditions

由表1可知，根据极差计算得到因素主次顺序为：B＞C＞A，即pH值＞ NaCl质量浓度＞葡萄糖质量浓度。计算分析因素水平优组合为A3B3C1，不同于正交试验中指标最高的第5组A2B3C1，经验证实验两组结果分别为11.52 μg/mL与11.89 μg/mL，显著差异（P＜0.05），具有统计学意义，确定优组合为A2B3C1，即葡萄糖质量浓度7 g/L、pH 7.2、NaCl质量浓度2 g/L。

表2 方差分析表Table2 Analysis of variance

由表2方差分析可知，B因素的F值大于F临界，这说明pH值对雌马酚产量的影响显著（P＜0.05）。A因素和C因素的F值均小于F临界，这说明葡萄糖质量浓度和NaCl质量浓度对雌马酚产量的影响不显著。

3 结 论

通过对从素食者粪便中分离出的产雌马酚LJ-G1 和LJ-Q2两株菌生长特性的研究发现，生长规律为37 ℃厌氧条件下，培养6 h后进入指数期、21 h后进入生长平稳期、39 h后为衰亡期。MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3对2 株菌的生长均有不同程度的抑制作用，其中MnSO4的作用最强。在对菌生长有促进作用的糖中，葡萄糖最明显，其次是麦芽糖和乳糖。生长条件优化得出（按培养基体积计）葡萄糖质量浓度7 g/L、pH 7.2、NaCl质量浓度2 g/L，雌马酚产量11.89 μg/mL。目前有关人体产雌马酚肠道菌生长特性研究的相关报道几乎未见到，今后还将依据素食者饮食特点在肠道环境方面，筛选影响产雌马酚菌生长因素水平，进一步优化指数期和延长平稳期培养条件，为其最终实现体外采用生物发酵法制备雌马酚奠定基础。

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Growth Characteristics of Equol-Producing Bacterial Strains from the Intestinal Tract of Vegetarians and Optimization of Culture Conditions for Enhanced Equol Production

LI Xiao-mei, JIA Yao
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Two anaerobes isolated from the feces of female vegetarians, LJ-G1 and LJ-Q2, were demonstrated to capable of metabolizing soybean isof avones to produce equol. The number of colonies, optical density and equol production was plotted against culture period for either of the two strains. The impact of MnSO4, ZnSO4, CaCl2, Na2CO3and KNO3on bacterial growth was explored. Meanwhile, the utilization of different carbon sources such as lactose, maltose, sucrose, corn starch and glucose by the anaerobic strains was screened. The culture conditions for equol production were optimized by single factor and orthogonal array designs. The results showed that LJ-G1 and LJ-Q2 were preferred to grow at 37 ℃under anaerobic conditions. Their growth was at the exponential phase after 6 h of cultivation, the stationary phase after 21 h and the decline phase after 39 h. All investigated metal salts could inhibit the growth of the strains, with MnSO4being the strongest inhibitor, whereas glucose had a positive effect on the growth of these intestinal strains. The optimized culture conditions that provided a higher equol production of 11.89 μg/mL were 7 g/L glucose and 2 g/L NaCl in the medium with an initial pH of 7.2.

vegetarians; intestinal bacteria; equol

TS201.3

A

1002-6630（2014）23-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201423039

2014-06-25

黑龙江省自然科学基金项目（C201201）；黑龙江省高校科技创新团队建设计划项目（2010td04）

李笑梅（1960—），女，教授，本科，研究方向为食品科学。E-mail：lixm0451@163.com