硒化党参多糖的制备及其抗氧化性能研究

金黎明，刘李娜，许永斌，张丽影，郑 维，范圣第

(1.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116605;2.海军医学研究所，上海 200443)

党参(Codonopsis pilosula)是中国传统补益药，其味甘性平，有补中益气、健脾生津之功效。其中党参多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide，CPP)系其主要有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降低胆固醇、降血脂、增强免疫调节功能、促进细胞增殖和骨细胞生长、保护肝肾等器官损伤以及治疗慢性荨麻疹、糖尿病等多种功效［1］。

硒(selenium)是人体所必需的微量元素之一，具有抗氧化、延缓衰老、抗癌、增强人体免疫力等功效。但大多数无机硒化合物毒性较大，应用受到极大的限制。硒多糖作为一种有机硒化合物，比无机硒安全，且兼有硒与多糖二者的优点，更加易于机体的吸收和利用［2］。目前已有许多研究证明，硒多糖具有抗金属中毒、抗氧化、抗癌细胞及抗病毒等多种作用［3－4］。

有些动植物和微生物体内含有天然硒多糖，但是含量很少，使得硒多糖的研究受到了一定限制。近年来，研究者尝试使用人工方法获得硒多糖，如在合适的培养条件下把无机硒添加到藻类、真菌等培养基中，通过生物体自身富集和转化来获得硒多糖［5－6］。此外，也可以利用化学合成方法获得硒多糖。如硒化角叉菜胶［7］、硒化红薯叶多糖［8］、硒化枸杞多糖［9］、硒化白沙蒿多糖［10］、硒化羧甲基壳聚糖［11］等多种富硒产品［12］，但是尚未见硒化党参多糖的报道。

本实验以亚硒酸钠和党参多糖为原料合成硒化党参多糖(selenium－Codonopsis pilosula polysaccharide，SeCPP)，利用电感耦合等离子体质谱(ICP－MS)法测定其中硒含量，利用紫外－可见光谱、红外光谱两种方法对其进行表征，并采用邻二氮菲－Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化法测定SeCPP的抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

仪器:7700X Series型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司);Lambda25型紫外－可见分光光度计(美国PE公司);370DTGS型红外光谱仪(美国Thermo公司);DF－101S型恒温磁力搅拌器(巩义市英峪于华仪器厂);DHG－9070A型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);Seven Easy型pH计(上海梅特勒－托利多仪器有限公司)。

试剂:党参提取物(西安天一生物技术有限公司);亚硒酸钠、无水乙醇、冰乙酸、盐酸、硝酸、甲苯、浓硝酸、双氧水、邻苯三酚、邻二氮菲、抗坏血酸(Vc)等，均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 党参多糖的纯化

称取10 g党参多糖提取物，加入100 mL蒸馏水将其溶解，加入20%体积的正丁醇－氯仿混合液(体积比为1∶5)，剧烈振荡20 min。4 000 r·min－1离心10 min，倾出上清液，除去中间层变性蛋白和下层氯仿。重复以上操作，直至中间层无变性蛋白。向上清液中加入3倍体积的无水乙醇，冰箱冷藏过夜，得到多糖沉淀，冷冻干燥得到纯化的CPP。

1.2.2 党参多糖中多糖含量测定

用苯酚－硫酸法测定CPP中多糖含量［13］。

1.2.3 硒化党参多糖的制备

参考梁淑轩［9］的方法，称取1 g纯化后的CPP溶解于25 mL超纯水中，磁力搅拌溶解后加入1 mL冰醋酸。取1 g亚硒酸钠溶于少量超纯水，缓慢加入上述CPP溶液中，加热至50℃，搅拌下反应48 h。反应毕，加入3倍体积无水乙醇，使其沉淀完全。离心得到沉淀后用无水乙醇洗涤3次，加入少量的超纯水溶解，用超纯水透析24 h，未透液经冷冻干燥得到SeCPP。

1.2.4 紫外光谱法测定

将CPP和SeCPP用去离子水配成0.5 mg·mL－1的溶液，用去离子水为参比，进行紫外光谱测定，波长扫描范围为190～400 nm。

1.2.5 红外光谱法测定

将少量的CPP和SeCPP用KBr压片，进行红外吸收光谱测定，测定范围为400～4 000 cm－1。

1.2.6 电感耦合等离子体质谱(ICP－MS)法测定硒含量

准确称取适量SeCPP于干燥的聚四氟乙烯消解罐内，加入4 mL硝酸及1 mL H2O2摇匀，密封，置入微波消解系统中进行消解，消解完全后，用少量超纯水洗罐3～4次，定容。用ICP－MS测定，样品定量分析采用外标法，内标元素选用89Y。分别做3次平行实验，取平均值。根据标准曲线计算硒含量。仪器工作参数见表1。

表1 Agilent 7700X Series ICP－MS工作参数

1.2.7 抗氧化能力测定

采用邻苯三酚自氧化法测定CPP和SeCPP清除超氧阴离子自由基的能力，以Vc为对照实验［14］。

采用邻二氮菲－Fe2+氧化法测定CPP和SeCPP清除羟自由基的能力，以Vc为对照实验［14］。

2 结果与讨论

2.1 党参多糖中多糖含量测定

葡萄糖标准曲线如图1，由此计算得出纯化后的CPP中多糖质量分数为78.95%。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 硒化党参多糖的制备及硒含量测定

得到的SeCPP为深棕色固体粉末，产率为43.65%。经ICP－MS测定其中硒的质量分数为25.92 mg·g－1。

目前化学法合成硒化多糖常用SeOCl2、亚硒酸、亚硒酸钠等作为硒化试剂。Wang等［10］用H2SeO3/HNO3和BaCl2作催化剂，合成了硒化白沙蒿多糖，发现强酸会使多糖降解。本实验参考了梁淑轩等［9］的方法，以醋酸作为催化剂，操作简单、安全，并综合考虑制备成本及操作的简便性，确定反应温度为50℃，反应时间为48 h。制备得到的SeCPP中硒的质量分数为25.92 mg·g－1，高于某些文献报道的结果，如合成的硒化红薯叶多糖中硒的质量分数为 358 μg·g－1［8］、合成的硒化白沙蒿多糖中硒的质量分数为 1 703 μg·g－1［10］、合成的硒化羧甲基壳聚糖中硒的质量分数为20.50 mg·g－1［11］。

目前测定硒含量的方法有ICP－MS法、比色法、原子吸收光谱法、气相色谱法及荧光分光光度法等，其中ICP－MS法因具有测定快速、灵敏度高、准确性好等特点被公认为是较好的方法［15］。本文使用ICP－MS法测定硒含量，结果准确可靠。

2.3 紫外图谱

党参多糖和硒化党参多糖的紫外吸收光谱图如图2。

图2 党参多糖和硒化党参多糖的紫外吸收光谱图

从图2中可以看出，CPP经硒化后，最大吸收峰从277 nm红移到279 nm，同时，225 nm处的吸收峰消失。峰值的变化表明CPP结构发生了变化，由此推测CPP中成功地引入了亚硒酸根。

2.4 红外图谱

党参多糖和硒化党参多糖的红外光谱图如图3。

图3 党参多糖和硒化党参多糖的红外光谱图

由图3可知，经硒化后的CPP红外图谱变化不大，说明多糖的结构基本没有改变。硒化后，在802 cm－1处出现有亚硒酸酯的特征吸收峰。CPP的C6－OH的伸缩振动峰由1 027 cm－1红移至1 022 cm－1，说明C6上的－OH可能参与了硒化反应，形成－SeH结构。

2.5 对超氧阴离子自由基的清除作用

党参多糖和硒化党参多糖对超氧阴离子自由基的清除率曲线如图4。

图4 党参多糖和硒化党参多糖对超氧阴离子自由基的清除率曲线

从图4可以看出，在实验设置的浓度范围内，CPP和SeCPP对超氧阴离子自由基均有不同程度的清除作用。结果表明，CPP和SeCPP对超氧阴离子自由基的清除作用随着浓度的增加而增强，且SeCPP的清除作用强于CPP。质量浓度为2.0 mg·mL－1的CPP和SeCPP对超氧阴离子的清除率分别为47.05%和54.46%。

2.6 对羟自由基的清除作用

党参多糖和硒化党参多糖对羟自由基的清除率曲线如图5。

图5 Vc对超氧阴离子自由基的清除率曲线

从图5可以看出，CPP和SeCPP对·OH均有一定的清除作用。结果表明，清除作用与质量浓度成正比，且SeCPP的清除能力更强。质量浓度为2.0 mg·mL－1的 CPP 和 SeCPP，对·OH 的清除率分别达到了50.20%和61.75%。

3 结论

本实验以亚硒酸钠和CPP为原料合成SeCPP，经ICP－MS测定其中硒的质量分数为25.92 mg·g－1。利用紫外 － 可见光谱、红外光谱两种表征手段对其结构进行表征，证实了SeCPP的合成，硒化反应主要通过C6上的－OH完成。SeCPP的抗氧化能力随着质量浓度的增加而增加，且高于 CPP。2.0 mg·mL－1的 CPP和SeCPP对超氧阴离子自由基的清除率分别为47.05%和54.46%，对羟自由基的清除率分别为 50.20%和 61.75%。

随着科学技术的发展，富硒产品的种类也越来越丰富，富硒鸡蛋、富硒食用菌、富硒茶叶、富硒禽肉、富硒蔬菜瓜果、富硒干果、富硒保健品等相继出现。本实验合成了一种新型的有机硒产品——硒化党参多糖，为进一步研究低毒性、高活性的有机补硒剂提供了思路与参考。

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(责任编辑 邹永红)