β－环糊精对多菌灵的荧光增敏效应研究

姜慧明，杨 红

(大连民族学院a.生命科学学院;b.环境与资源学院，辽宁大连 116605)

β－环糊精是一种具有疏水空腔和亲水表面的超分子主体化合物，具有分子识别功能，能够选择性地结合有机分子形成主客体超分子化合物。β－环糊精超分子包合物具有许多特点，比如溶解性能、化学性能、pKa值、扩散性能、电化学性能以及光化学性能等［1］。目前认为，β－环糊精引起荧光增强的主要因素是增加发射速度常数，减少分子移动自由度，避免去活碰撞，保持适宜的微环境以及保护激发态不与大体积水分子和猝灭剂接触。段云青等［2］通过实验数据推测，溴敌隆结构中的疏水基团4－羟基香豆素母环或者溴代联苯基进入了β－环糊精的疏水空腔之中，形成超分子包络物引起荧光显著增强，这为环糊精荧光增强机理的研究提供了必要的依据。但是目前对其荧光增敏机理的研究还基本处于推测阶段。

多菌灵(carbendazim)，化学名称为N－(2－苯骈咪唑基)－氨基甲酸甲酯，又名棉萎灵、苯井咪唑44号，结构式如图1。

图1 多菌灵的结构

多菌灵是一种高效低毒内吸性杀菌剂，对农作物具保护和治疗作用。对子囊菌亚门、半知菌亚门病原真菌有效，对鞭毛菌亚门真菌和细菌无抑制活性，可用于防治禾谷类作物、棉花、油菜和其他作物的多种病害。多菌灵化学性质稳定，能被植物的种子、根和叶吸收，残效期较长，对人、畜均有一定毒性，可引起抽搐、精神恍惚、恶心呕吐、胸闷、头晕等中毒症状。因此，有关多菌灵残留量的分析已经越来越受到重视。

虽然多菌灵在农作物病害的防治方面有着广泛的应用，但对人体又有一定的毒害性，目前世界许多国家都制定了多菌灵在不同种(类)农副产品中残留量的最高限量标准。加拿大国家标准规定黄瓜、西葫芦等蔬菜中多菌灵残留量每公斤不得超过0.5 mg;马来西亚规定蔬菜类中多菌灵残留量每公斤不得超过1 mg;中国卫生标准GBl4870－94中规定蔬菜、水果中多菌灵残留量每公斤不得超过 0.5 mg。

多菌灵的测定目前主要采用液液萃取法［3］、固相萃取法［4－5］和二氧化碳超临界萃取法［6］等;测定方法主要有分光光度法［7］、毛细管电泳法［4］、气相色谱法［8］、液相色谱法及液相色谱质谱法［9］等，荧光法尚未进行深入研究。

本文探讨了多菌灵的荧光光谱，以及在β－环糊精存在下多菌灵的荧光增强效应，旨在建立一种快速高效的荧光测定多菌灵含量的方法，为以β－环糊精作为超分子主体化合物对客体分子的荧光增敏效应研究提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

仪器:RF－5301PC荧光分光光度计(SHIMADZU，日本)。

试剂:多菌灵，纯度99.9%(沈阳农业大学植保学院农药研究室友情赠送)，配成0.08 mg·mL－1的乙醇/水溶液;β－环糊精(国药集团化学试剂有限公司)，二次重结晶，60℃真空干燥后配成0.01mol·L－1水溶液;羟丙基环糊精(HPCD，上海源叶生物科技有限公司)，二次重结晶，60℃真空干燥后配成0.01 mol·L－1水溶液。实验用水为二次蒸馏水。

Britton－Robinson(B－R)缓冲溶液的配置:取 H3BO30.6183 g，85% 的 H3PO40.68 mL，36%的乙酸1.16 mL，用蒸馏水配成250 mL的三酸混合液;再取2.0 g NaOH，配置成0.2 mol·L－1溶液，将配好的三酸混合液与NaOH溶液以不同体积混合，可配置成不同pH的B－R缓冲溶液。

1.2 方法

移取一定量的多菌灵溶液，加入不同量的B－R缓冲溶液及β－环糊精或HPCD溶液后移入25 mL比色管中，加水定容，室温下振荡10 min，然后测定溶液的相对荧光强度。

2 结果与讨论

多菌灵的激发和发射谱如图2，确定测定波长λex/em=284/306 nm。

图2 多菌灵的激发和发射谱(狭缝宽度均为5 nm)

2.1 β－环糊精浓度的影响及包合常数测定

在确定了多菌灵的激发和发射波长后，笔者在多菌灵溶液中加入了不同浓度的β－环糊精，得到了一系列荧光光谱，见表1和图3。

表1 不同β－环糊精浓度下多菌灵的荧光强度

图3 不同β－环糊精浓度下多菌灵的荧光发射光谱(狭缝宽度均为5 nm)

β－环糊精浓度对多菌灵荧光强度的影响如图4。

图4 β－环糊精浓度对多菌灵荧光强度的影响

由表1和图3、图4可以清楚看出，多菌灵溶液在加入β－环糊精后，荧光强度有了明显的增强。在β－环糊精的浓度范围为8×10－4～5.6×10－3mol·L－1，多菌灵的荧光强度随着 β － 环糊精浓度的增加而增强，继续增加β－环糊精的浓度，荧光强度呈下降趋势。

β－环糊精对多菌灵的的荧光增敏作用是由于多菌灵在疏水作用、范德华力及氢键力等非共价键作用的驱动下，进入β－环糊精空腔形成超分子包合物，在空腔内多菌灵分子的运动自由度以及水分子的松弛效应大大降低，阻止了碰撞失活，减少了非辐射跃迁的几率;环糊精空腔所提供的非极性微环境近似于有机介质［10］，使多菌灵分子的荧光在β－环糊精空腔中受到保护和屏蔽，减少了与腔体外主体溶液中水分子、氧等碎灭剂的接触;空腔尺寸大小与极性对客体进行选择性识别包结。据此，本实验建立了水溶液中高灵敏度与高选择性测定多菌灵的荧光光谱法。

假设在β－环糊精包合体系中，主客体的化学计量比为1∶1，即S+CD↔CD－S，则包合物的形成常数 K=［CD － S］/［S］［CD］，其中［S］［CD］［CD－S］分别表示客体S、主体CD和包合物CD－S的平衡浓度。根据Benesi－Hildebrand的双倒数法，得到如下公式:

式中，F指在不同β－环糊精浓度下分别测得的荧光强度;F0指不加β－环糊精，多菌灵溶液测得的荧光强度;F∞指所有的多菌灵完全被β－环糊精环糊精包合后，测得的荧光强度。一般控制CD浓度远大于S浓度，因此［CD］可用其原始浓度表示。

将所得实验数据按1/(F－F0)对1/［CD］作图，可得一线性关系较好的直线(R=0.992 7)，说明主客体间形成了1∶1的超分子包合物。由直线的截距与斜率之比可求得β－环糊精－多菌灵的结合常数 K=3.2 ×102(L·mol－1)，如图5。

图5 β－环糊精－多菌灵一元包合物关系式方程曲线

假设在环糊精包合物中，主客体的化学计量比为2∶1，则 S+2β －CD↔(β －CD)2－S。

将测得的实验数据按1/(F－F0)对1/［CD］2作图，不呈直线(如图6)，因此主客体的化学计量比不是2∶1。

图6 β－环糊精－多菌灵二元包合物关系式方程曲线

2.2 pH值对多菌灵荧光强度的影响

β－环糊精对碱稳定，但在强酸性介质中将分解为由开环产物直至葡萄糖组成的混合物。本文探讨了pH=2.0～10.0范围内β－环糊精与多菌灵包结及其对荧光强度的影响，结果如图7。体系的pH值是由B－R缓冲溶液来调节的。

图7 pH值对β－环糊精包结多菌灵荧光强度影响的工作曲线

由图7可以看出，在中性、弱酸性、弱碱性条件下，β－环糊精包结多菌灵的荧光强度都很强，其中以pH=7.6的溶液荧光强度最大。在强酸性溶液中(pH=2.29～4.06)，多菌灵的荧光强度发生了很大变化，306 nm处的发射峰基本消失了，这预示着多菌灵的结构发生了变化。由多菌灵的结构可以看出，多菌灵在酸性溶液中会变成铵盐，从而改变了其荧光吸收性质。本实验选择pH=7.6作为荧光测定的最佳pH值。

2.3 工作曲线、检测下限和精密度

由表1看出，当β－环糊精的浓度为5.6×10－3mol·L－1时，多菌灵的荧光强度最大，因此在测定多菌灵的工作曲线时，固定β－环糊精的浓度为5.6 ×10－3mol·L－1而改变多菌灵的质量浓度，得到了多菌灵在不同质量浓度时的荧光强度，见表2和图9。

表2 多菌灵不同浓度时的荧光强度(固定 β －环糊精的浓度为 5.6×10－3mol·L－1)

图8 不同浓度多菌灵的荧光强度曲线(狭缝宽度均为5 nm)(谱图自下而上编号依次为15，14，13…10)

图9 多菌灵的工作曲线

由图9可以看出，多菌灵在0.46～6.16 ng·mL－1范围内呈现良好的线性关系，回归方程为F=5.37 C(ng·mL－1)+148.54，相关系数为0.999 3。依照 IUPAC规定，CL=kS0/S，其中 CL为检测下限，k为与置信水平相关的常数，S0为n次空白溶液测定值的标准偏差(S0=0.11)，S为标准工作曲线的斜率。当置信水平为90%时k取3，计算求得本法的检测限为0.06 ng·mL－1。0.77 ng·mL－1多菌灵标准溶液9次平行测得值的相对标准偏差为1.2%。

3 结论

本文讨论了多菌灵在与β－环糊精包合后的荧光光谱，结果发现，在pH=7.6的溶液中，β－环糊精对多菌灵具有很强的荧光增强效应，且形成了1∶1的超分子体系，包合常数K=3.2×102(L·mol－1)。随着荧光强度的增强，该体系对多菌灵的检测限也大大提高，达到了60 pg·mL－1，是目前已经发表的最好结果 4.78 ng·mL－1［11］的百分之一，该研究结果对提高农药残留检测灵敏度具有比较重要的应用价值。

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(责任编辑 邹永红)