溃疡性结肠炎的微生态学改变及双歧杆菌的治疗作用研究

邱春雷，严 红，吴雄健，刘洪荣

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以结肠黏膜弥漫性炎性损害为主要病理特征的消化系统疾病，是一种多因素、病因不清的慢性非特异性炎症性肠道疾病[1]。患者常出现腹痛、腹泻、血便等临床症状，个别患者有时出现贫血或急剧疼痛，发病年龄为20～50岁。国内外流行病学调查结果显示，UC发病率和死亡率均呈明显上升趋势，严重威胁人们的生命健康，已被WHO列为现代难治病之一。至今为止，UC的病因和发病机制尚未明确，尽管对其治疗做了很多研究，但仍未取得满意疗效和突破性进展[2]。大量研究证实，菌群与UC关系密切，肠道菌群失调被认为是UC发生的重要原因之一[3]；实验研究和临床研究均证明肠道益生菌可改善UC患者菌群失调和自身免疫功能，从而缓解或消除肠道炎症[4-5]。本研究通过检测活动期UC(active ulcerative colitis，AUC)和缓解期UC(remissive ulcerative colitis，RUC)患者粪便菌群，观察其微生态学改变及双歧杆菌对UC的治疗作用，探讨UC发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年5月—2013年3月在井冈山大学附属医院门诊就诊或住院的AUC患者64例(AUC组)和RUC患者71例(RUC组)，病程3个月～20年；另选取同期在本院体检健康者30例(对照组)，半年内均未服用过抗生素。AUC组中男33例、女31例，年龄21～57岁；RUC组中男38例、女33例，年龄20～59岁；对照组中男15例、女15例，年龄21～55岁。UC的诊断符合2007年中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组颁布的“对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见”中的诊断标准。患者或其监护人、对照者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、拟杆菌、普雷沃氏菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、肠球菌、柱状真杆菌和普拉梭菌16SrDNA基因序列[6]，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计PCR引物。引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，各引物序列见表1。

表1 肠道菌群16SrDNA基因特异性引物序列

Table1 Species-specific primers sequence of 16SrDNA gene of bacterial group

肠道菌群上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)退火温度(℃)长度(bp)双歧杆菌CTCCTGGAAACGGGTGGTGCTGCCTCCCGTAGGAGT55168乳酸杆菌AGCAGTAGGGAATCTTCCACACCGCTACACATGGAG50267大肠埃希菌CATGCCGCGTGTATGAAGAACGGGTAACGTCAATGAGCAAA5276拟杆菌GGTTCTGAGAGGAGGTCCCGCTGCCTCCCGTAGGAGT5558普雷沃氏菌CAGCAGCCGCGGTAATAGGCATCCATCGTTTACCGT50245球形梭菌ACTCCTACGGGAGGCAGCGCTTCTTAGTCAGGTACCGTCAT55206柔嫩梭菌GTTGACAAAACGGAGGAAGGGACGGGCGGTGTGTACAA53213肠球菌CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATACTCGTTGTACTTCCCATTGT51132柱状真杆菌ACTCCTACGGGAGGCAGCCATTGCTCGTTCAGGGTTC5384普拉梭菌CAGCAGCCGCGGTAAACTACCTCTGCACTACTCAAGAAA52116通用引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTATTACCGCGGCTGCTGGC56174

1.2.2 肠道菌群培养 称取所有受试者新鲜粪便，按1∶10比例加入磷酸盐缓冲液(PBS)进行稀释，震荡后充分混匀，需氧菌稀释度为107～108，厌氧菌稀释度为108～109。采用不同的选择性培养基进行培养，每个平板均匀涂布50 μl稀释液，每种菌群涂布3个平板。双歧杆菌采用BBL琼脂，乳酸杆菌采用Lbs琼脂，大肠埃希菌和普雷沃氏菌采用伊红美蓝琼脂，拟杆菌采用胆汁-七叶甙(BBE)琼脂，球形梭菌、柔嫩梭菌和普拉梭菌采用哥伦比亚琼脂，肠球菌采用叠氮钠-结晶紫七叶苷琼脂，柱状真杆菌采用ES琼脂。需氧菌培养18～24 h，厌氧菌培养48～72 h，计算同一稀释度下平均菌落数，以lg n/g表示。

1.2.3 粪便细菌DNA提取 参照《分子克隆操作指南》和文献[7]介绍的方法加以改良：收集所有受试者粪便标本，取1 g粪便加0.01 M的PBS 9 ml，充分颠倒混匀后以1 000 r/min低速离心5 min，离心半径为10 cm，取上清液，上述过程重复3次，收集上清液以14 000 r/min高速离心10 min后取沉淀，离心半径为10 cm，反复用PBS洗涤3次，水洗1次，沉淀即为粪便总细菌。按细菌基因组DNA快速提取试剂盒的操作说明提取总细菌DNA并检测其浓度，-20 ℃冰箱保存备用。标准菌株37 ℃摇床200 r/min培养过夜，离心半径为10 cm，次日收集菌体并按细菌基因组DNA快速提取试剂盒的操作说明提取细菌DNA。

1.2.4 常规PCR与荧光定量PCR 采用长双歧杆菌CICC6068、嗜酸乳杆菌CICC6088、大肠埃希菌ACCC11864、粪肠球菌ACCC10699、拟杆菌CICC10402、普雷沃氏菌ATCC25845、柔嫩梭菌ATCC29065、普拉梭菌ATCC27766、柱状真杆菌ATCC27803、球形梭菌ATCC29236标准菌株进行常规PCR扩增。50 μl反应体系为：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，模板5 μl，上、下游引物各1 μl，石蜡20 μl，补充灭菌超纯水至50 μl。扩增参数：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s、退火(温度见表1)30 s、72 ℃延伸30 s(共30个循环)，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳。

将上述标准菌株扩增产物回收、纯化，作为制作荧光定量PCR标准曲线的标准品。标准品和待测样品DNA进行16SrDNA荧光定量PCR反应。25 μl反应体系为：2×SYBR®Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，50×ROX Reference DyeⅡ 1 μl，DNA模板2 μl，补充灭菌超纯水至25 μl。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、退火(温度见表1)34 s、72 ℃延伸30 s(共40个循环)72 ℃延伸10 min，95 ℃变性15 s、退火(温度见表1)1 min、72 ℃延伸30 s，循环1次得到溶解曲线。

1.2.5 治疗方法及疗效判断标准 将AUC组患者按随机数字表法分为AUC1组32例和AUC2组32例，RUC组患者按随机数字表法分为RUC1组36例和RUC2组35例，AUC1组和RUC1组患者口服诺氟沙星胶囊(氟哌酸胶囊)，3粒/次，2次/d；AUC2组和RUC2组口服双歧杆菌活菌胶囊(丽珠肠乐胶囊)，2粒/次，3次/d。4个亚组治疗疗程均为1个月，同时口服柳氮磺胺吡啶片，1.0 g/次，4次/d。疗效判断标准：(1)临床疗效：①显效：排便恢复正常，无腹痛现象；②有效：粪便颜色正常，腹痛减轻、偶尔腹泻；③无效：症状无变化。(2)组织学疗效：①显效：肠镜下可见黏膜轻度充血、溃疡较前缩小或基本消失，病理切片可见黏膜细胞和腺体基本正常，炎性细胞明显减少；②有效：肠镜下可见黏膜部分充血、水肿减轻，部分肠黏膜组织接近正常，病变范围较前缩小，病理切片可见黏膜细胞部分修复，有少量炎性细胞；③无效：肠镜及病理切片观察与治疗前相比无变化。

1.2.6 分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量检测 称取所有受试者新鲜粪便，按1∶2加入0.01 M的PBS，震荡后充分混匀，12 000 r/min低温离心30 min，离心半径为10 cm，取上清液，按照sIgA放射免疫分析试剂盒说明书，采用放射免疫分析法测定sIgA含量，操作步骤如下：取100 μl上清液，依次加入100 μl125I-sIgA和100 μl sIgA抗体，充分混匀，37 ℃水浴60 min，加入二抗混匀，37 ℃水浴30 min，4 ℃放置10 min，3 000 r/min离心15 min，离心半径为10 cm，弃上清液，取沉淀在液体闪烁计数仪上计数，根据标准曲线计算样本中sIgA含量。

1.2.7 线粒体膜蛋白(Apo-2.7)含量检测 用活检钳取UC患者结肠溃疡边缘新鲜组织及对照者正常结肠组织0.5～1.0 g，剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm小碎块，于200目网筛研磨，然后用PBS冲洗，滤液以1 500 r/min离心5 min，离心半径为10 cm，PBS冲洗2次，1 000 r/min离心5 min，离心半径为10 cm，弃上清液；调整细胞数至109/ml，加入20 μl Apo-2.7-PE，室温避光反应30 min。采用流式细胞仪收集10 000个细胞，测定光散射数并计算样本中Apo-2.7含量。

2 结果

2.1 肠道菌群菌落数 肠道菌群16SrDNA基因特异性引物分析：每对引物均只能扩增出一条片段，未出现非特异性条带，片段长度与预期一致(见图1)，可以用于后续荧光定量PCR反应。3组受试者普雷沃氏菌、柱状真杆菌菌落数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、拟杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、肠球菌、普拉梭菌及总细菌菌落数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，AUC组和RUC组双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、普拉梭菌及总细菌菌落数减少(P<0.05)，大肠埃希菌、肠球菌菌落数增加(P<0.05)；与RUC组相比，AUC组双歧杆菌、乳酸杆菌菌落数减少(P<0.05)，大肠埃希菌菌落数增加(P<0.05,见表2)。

2.2 临床疗效和组织学疗效 4个亚组患者在治疗过程中均未出现明显不良反应。AUC2组临床疗效和组织学疗效均优于AUC1组(u值分别为96.000和128.000，P<0.05)；RUC2组临床疗效和组织学疗效均优于RUC1组(u值分别为72.000和144.000，P<0.05，见表3)。

注：1为肠球菌，2为双歧杆菌，3为大肠埃希菌，4为柔嫩梭菌，5为通用引物，6为柱状真杆菌，7为普拉梭菌，8为球形梭菌，9为拟杆菌，10为乳酸杆菌，11为普雷沃氏菌

图1 肠道菌群16SrDNA基因特异性引物PCR扩增结果

Figure1 PCR result of species-specific primers of 16SrDNA gene of bacterial group

2.3 4个亚组治疗后肠道菌群菌落数比较 治疗后，AUC2组双歧杆菌、乳酸杆菌菌落数较AUC1组增加，大肠埃希菌菌落数较AUC1组减少(P<0.05)；RUC2组双歧杆菌、乳酸杆菌菌落数较RUC1组增加，大肠埃希菌菌落数较RUC1组减少(P<0.05)；AUC2组与AUC1组、RUC2组与RUC1组其他肠道菌群及总细菌菌落数比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表4～5)。

表3 4个亚组患者临床疗效和组织学疗效比较(例)

Table3 Comparison of clinical efficacy and histological efficacy in the four subgroups

组别例数临床疗效显效 有效 无效组织学疗效显效 有效 无效AUC1组326141251314AUC2组321316310184RUC1组361861214715RUC2组352211211204

2.4 sIgA含量与Apo-2.7含量 对照组与AUC1组、RUC1组sIgA、Apo-2.7含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；AUC2组sIgA含量高于AUC1组，Apo-2.7含量低于AUC1组，差异均有统计学意义(P<0.05)；RUC2组sIgA含量高于RUC1组，Apo-2.7含量低于RUC1组，差异均有统计学意义(P<0.05)；AUC2组和RUC2组sIgA、Apo-2.7含量与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表6)。

表2 3组受试者肠道菌群菌落数比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与RUC组比较，△P<0.05

表4 AUC1组和AUC2组治疗后肠道菌群菌落数比较

表5 RUC1组和RUC2组治疗后肠道菌群菌落数比较

Table6 Comparison of sIgA and Apo-2.7 levels in control group and the four subgroups

组别例数sIgA(μg/g)Apo-27(%)对照组30138088±11101243±033AUC1组32103107±8842∗1147±222∗AUC2组32135175±8852△258±064△RUC1组36116860±10145∗708±113∗RUC2组35139873±11080▲305±035▲F值10558252840P值00000153

注：与对照组比较，*P<0.05；与AUC1组比较，△P<0.05；与RUC1组比较，▲P<0.05；sIgA=分泌型免疫球蛋白A，Apo-2.7=线粒体膜蛋白

3 讨论

UC是一种病因和发病机制不明的复杂慢性炎症性肠病，主要病变表现为结肠黏膜炎症或溃疡，一般自远端结肠逆行至近端结肠，严重时可遍及整个结肠或累及直肠[8]。UC在发达国家相当常见，而在我国该病极少见，但近20年来UC在我国呈不断上升趋势，尽管对UC病因进行了大量研究，但至今仍未取得突破性进展。一般认为，UC与感染、机体免疫、黏膜免疫、肠道微生物、细胞因子、氧自由基、神经内分泌和遗传等有关，机体菌群失调是UC的重要病因之一。微生态学研究显示，在正常生理状态下，定居于肠道的细菌种类达500多种，约为1 012 CFU/g，且主要集中于结肠和末端小肠；双歧杆菌属、类杆菌属、乳酸菌属等专性厌氧菌是肠道菌群的生理性优势菌，约占肠道总菌量的99%，其余1%主要是肠杆菌、肠球菌属等兼性厌氧性条件致病菌和变形杆菌、假单胞菌等过路病原菌[9]。正常情况下，绝大多数肠道菌群对人体是有益的，能相互依存、相互制约，使得肠道微生态保持平衡状态。但这些潜在的致病菌一旦被外界因素激发，平衡被打破，引起肠道微生态失调即可造成炎症，外界因素包括抗生素、细胞毒性药物、激素、免疫抑制剂等化学因素以及射线、手术、创伤等物理因素。众多临床研究表明，UC患者发病和复发与肠道菌群改变密切相关，肠道细菌及其产物等可作为抗原诱导某些具有遗传易患性的个体肠道黏膜免疫功能失衡，使肠道免疫系统对肠道抗原耐受性减退甚至消失，进而引发肠道炎症[10]。本研究结果显示，与健康对照者相比，无论是AUC患者还是RUC患者，其肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌、普拉梭菌及总细菌菌落数均有不同程度减少，大肠埃希菌和肠球菌菌落数增加；与RUC患者相比，AUC患者双歧杆菌和乳酸杆菌菌落数减少，而大肠埃希菌菌落数增加。

近年研究表明，使用益生菌调理肠道微生态能够预防和控制UC[11-12]。目前临床上常用的益生菌制剂主要有：双歧杆菌活菌制剂(丽珠肠乐、回春生)，双歧杆菌三联活菌制剂(培菲康、金双歧、贝飞达)，枯草杆菌和粪球菌二联活菌制剂(美常安)，蜡样芽孢杆菌活菌制剂(促菌生)，地衣芽孢杆菌活菌制剂(整肠生)等。双歧杆菌是革兰阳性无芽孢厌氧杆菌，具有抗感染、抗肿瘤、抗衰老、免疫赋活、促消化等作用，对维持人体健康至关重要，临床研究也观察到双歧杆菌制剂防治肠道感染具有理想效果。本研究在柳氮磺胺吡啶治疗的基础上采用双歧杆菌活菌制剂丽珠肠乐对UC患者进行治疗，并与氟哌酸进行对照，结果显示，治疗后AUC2组、RUC2组双歧杆菌、乳酸杆菌菌落数分别较AUC1组、RUC1组增加，大肠埃希菌菌落数分别较AUC1组、RUC1组减少；AUC2组、RUC2组临床疗效和组织学疗效分别优于AUC1组、RUC1组，且4个亚组患者在治疗过程中均未出现明显不良反应。虽然目前双歧杆菌治疗UC的作用机制尚未完全阐明，但一般认为双歧杆菌可调节肠道菌群平衡，发挥多种生物拮抗功能，如通过营养争夺、产生酸性代谢产物、降低肠道局部pH值等而产生对肠道功能有重要作用的营养物质和广谱抗菌物质，如亲脂分子、细菌素、过氧化氢等，抑制或杀灭肠道大肠埃希菌、沙门氏菌、链球菌等致病菌。此外，双歧杆菌还可通过磷壁酸黏附作用而紧密结合在肠上皮细胞表面，形成一层菌膜屏障，阻止肠道内源性及外源性潜在致病菌易位、入侵和定植；促进抗炎细胞因子和抑制促炎细胞因子的分泌；增强先天性免疫细胞的吞噬功能。目前，关于益生菌灌肠疗法治疗UC的临床研究报道极少，还有待于进一步研究以阐明益生菌防治UC的机制。

正常机体血清中IgA含量仅次于IgG，按其免疫功能可分为血清型和分泌型，sIgA由黏膜相关淋巴结产生[13]，是机体黏膜免疫系统的最重要因子，主要分布于鼻、咽、气管、胃肠道和泌尿生殖道分泌液中，能抵抗微生物在黏膜上皮附着，减缓病毒繁殖，是防止病原体入侵机体的第一道防线[14]。外来抗原进入呼吸道或胃肠道，局部免疫系统受到刺激后，其无需中枢免疫系统参与就可以自行进行免疫应答，产生sIgA，sIgA含量变化直接反映机体黏膜局部免疫状态。肠黏膜功能活跃，但十分容易受损，缺血、缺氧、氧化应激、酸中毒、肠道菌群失调以及炎性细胞因子刺激等均可损害肠黏膜免疫功能，肠道生化内环境改变可导致sIgA分泌减少，而sIgA作为肠黏膜免疫的重要组成部分和效应分子，其合成和分泌减少势必会削弱肠道免疫功能。王旭霞等[15]研究表明，sIgA含量变化与UC的发生密切相关；本研究结果亦显示，UC患者sIgA含量与健康对照者存在明显差异，提示UC患者肠道黏膜免疫功能存在不同程度地降低，双歧杆菌治疗有助于改善肠道黏膜免疫功能。国内外研究表明，肠道损伤、双歧杆菌显著减少可能导致sIgA合成和分泌减少，而补充双歧杆菌可降低血浆内毒素和IL-6水平，维持机体促炎、抗炎反应平衡，进而促进IL-4介导的sIgA的合成与分泌[16]。

细胞凋亡是一种受基因调控的自主性细胞程序性死亡过程，细胞发生凋亡时，常伴有凋亡调控基因表达的级联反应变化。Fas、FasL、Bcl-2、Bax、Apo、caspase等均参与了细胞凋亡过程。越来越多的研究表明，UC患者存在肠黏膜上皮细胞过度凋亡、黏膜固有层淋巴细胞抵抗凋亡以及中性粒细胞(PMN)凋亡迟滞，是造成UC患者肠道炎症发生和持续的重要原因[17]。Apo-2.7是一个大小为38 kDa的膜蛋白，是细胞凋亡的特异标志物。为了维持结肠黏膜屏障的动态平衡，正常机体结肠上皮黏膜细胞可表达低水平Apo-2.7用于调控衰老细胞凋亡，临床常用Apo-2.7判断黏膜病变损伤程度及病情活动度[18]。本研究结果显示，UC患者Apo-2.7含量与健康对照者存在明显差异，提示结肠黏膜上皮细胞凋亡增加可引起肠黏膜损伤，继而发生溃疡，双歧杆菌治疗有助于抑制结肠黏膜上皮细胞的凋亡。

总之，UC患者肠道共生菌数量减少，条件致病菌增加，双歧杆菌活菌制剂治疗UC疗效显著，UC发病可能与机体菌群失调、肠道免疫功能破坏及结肠黏膜上皮细胞过度凋亡有关。但本研究样本量较小，限于当前的研究水平，本研究所得结论仍存在较大局限性，双歧杆菌治疗UC的临床疗效和UC的发病机制还有待进行更多的临床研究观察和分析。

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