葛根通脉饮对兔动脉粥样硬化模型内质网应激信号转导通路相关分子表达的调控作用

赵君玫，张 娜，王建新，沈晓君，刘学芳

动脉粥样硬化(AS)是心血管系统最常见的疾病之一，是多种心血管系统疾病主要的病理基础，糖尿病、脂代谢紊乱、高同型半胱氨酸血症等独立的心血管危险因素也被证明部分通过诱导内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)而诱发AS[1-4]。内质网是细胞内最重要的细胞器之一，在蛋白质的翻译和加工修饰方面发挥着重要功效，病理情况下内质网蛋白折叠负荷以及处理该负荷能力之间的不平衡导致了ERS，ERS参与AS发生发展的全过程[5-6]。免疫球蛋白重链结合蛋白(binding immunoglobulin protein，BIP)，也称GRP78，是ERS反应途径中的重要分子伴侣，属于热休克蛋白(HSP70)家族成员之一，与内质网内的许多蛋白都有短暂的接触作用，是内质网内环境的灵敏感应器[7]。

临床研究显示，葛根通脉饮对AS及其所致的心脑血管疾病有一定的治疗作用，为进一步揭示该中药在AS发生发展过程中的作用机制，本研究以ERS信号通路中BIP为切入点，通过高胆固醇、蛋氨酸饮食建立兔高同型半胱氨酸血症诱导的AS模型，观察葛根通脉饮对同型半胱氨酸(Hcy)诱导的兔AS模型的ERS信号通路BIP mRNA和蛋白表达的影响，探讨其可能存在的延缓或治疗AS的作用，为葛根通脉饮抗AS药理学作用提供实验数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康日本大耳白兔32只，雄性，普通级，5月龄，体质量2.0～2.5 kg，由河南康达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0001。

试剂：葛根通脉饮(主要成分为葛根、山楂、太子参、当归尾、淫羊藿、赤芍、川芎和甘草)，由河南中医学院制剂室制备。Hcy(Sigma公司产品，25 g /瓶，纯度≥98%，批号：C-7352)。BIP原位杂交检测试剂盒(批号MK3679-rabbit，武汉博士德生物工程有限公司)；BIP：批号3158-1，分子量为78 kD(北京前景科创生物技术有限责任公司)。HRP标记抗鼠二抗：bs0296G-HRP，Lot：130916。HRP标记抗兔二抗：bs0295G-HRP，Lot：019997。BIP地高辛标记的寡核苷酸探针，按 BIP-mRNA 序列，rabbit BIP靶基因的mRNA序列为：(1)5′-GAAAA GAAAA CTAAA CCTTA CATTC AAGTT GACAT-3′；(2)5′-CAGCG TGTCA TGGAG CACTT CATCA AGCTC TACAA-3′；(3)5′-AGGA TTCTG ATTTG AAGAA GTCTG ACATT GATGA-3′；武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制备AS动物模型 将白兔适应性饲养1周，采用随机数字表法分为正常组、模型组、葛根通脉饮低剂量组(葛低组)、葛根通脉饮高剂量组(葛高组)，每组8只。正常组饲喂基础饲料；模型组饲喂高胆固醇饲料(在基础饲料中加入1%胆固醇及0.02%蛋氨酸)；葛低组(葛根通脉饮5 g·kg-1·d-1+高胆固醇饲料)；葛高组(葛根通脉饮10 g·kg-1·d-1+高胆固醇饲料)。每日每只兔定量给予饲料，待各组兔吃光后再给予基础饲料。各组兔均自由饮水，连续饲喂9周，复制AS模型。饲喂9周后开胸快速截取胸主动脉上段，置4%多聚甲醛和液氮罐中(-196 ℃) 中保存。

1.2.2 形态学观察 取兔胸主动脉上段(4%多聚甲醛固定)，按照常规步骤进行脱水、浸蜡、包埋、切片，采用苏木素-伊红(HE)染色的方法对组织进行观察，记录结果。

1.2.3 组织原位杂交检测血管平滑肌细胞(VSMC)BIP mRNA表达 取兔胸主动脉上段(4%多聚甲醛固定)，按常规步骤进行脱水、浸蜡、包埋、切片。参考文献[8]进行原位杂交：(1)灭活内源性酶，滴加30%过氧化氢(H2O2)1份+蒸馏水10份混合，室温处理10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗涤3次。(2)暴露mRNA核酸片段，切片滴加1 μg/ml蛋白酶K溶液〔100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0配制〕，37 ℃孵育10 min。磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，30 min/次。蒸馏水洗涤1次。(3)后固定，1%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.4)，含有1/1 000焦磷酸二乙酯(DEPC)，室温固定10 min，蒸馏水洗涤3次。(4)预杂交，每张切片加20 μl预杂交液，恒温箱38～42 ℃ 2～4 h。(5)杂交，每张切片加20 μl DNA探针/杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，切片放入烤箱中70 ℃，10 min使RNA变性，然后放入恒温箱38～42 ℃杂交过夜。杂交后洗涤。滴加蛋白封闭缓冲液，37 ℃ 30 min。滴加1滴兔抗地高辛-BSA，37 ℃ 60 min。PBS洗涤5 min×4次。滴加1滴HRP-羊抗兔IgG，37 ℃ 30 min。PBS 洗涤5 min×4次。(6)DAB显色。(7)苏木素复染，中性树胶封片。应用Leika DMR病理成像系统，每张切片选取2个高倍视野照相，每张图片随机选取5个区域测量其阳性区平均积分光密度，10个数据的均数作为此切片的mRNA相对表达量。

1.2.4 Western blotting杂交检测VSMC BIP蛋白表达 (1)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)：取兔胸主动脉上段蛋白35 μg与5×蛋白上样缓冲液混合均匀后于100 ℃水浴10 min，分别上样，100～200 V电泳至条带分离。(2)转膜：准备NC膜和Whatman滤纸，依次将滤纸(3张)、凝胶、NC膜、滤纸(3张)置于支撑架上，NC膜面对阳极侧。接通电源，4 ℃下300 mA恒流转膜，蛋白转移1.5 h，β-actin转移1.0 h。转膜完毕后，取出NC膜，用利春红染液染膜，检测转移效果。(3)封闭，抗体免疫及显色封闭：NC膜放入一平皿中，加入足量的5%脱脂奶粉封闭液(TBST配制)，室温下封闭2.5～3.0 h。加一抗BIP 1∶1 000；Chop 1∶1 000，37 ℃ 2 h；TBST漂洗3次，10 min/次；加二抗(HRP标记)，37 ℃ 2 h；TBST漂洗3次，10 min/次；ECL发光液混合，待膜干后，平铺其上；待反应5 min后，暗室压片5 min；显影1～3 min，水洗，定影1～3 min，照相。应用Leica DMR病理图像分析系统，分别测量目的蛋白和β-actin条带的积分光密度，以目的蛋白和β-actin条带的积分光密度比值判断BIP蛋白的相对含量。

2 结果

2.1 组织形态学观察 兔胸主动脉组织HE染色显示，正常组血管内膜光滑，内弹性膜明显，内皮细胞呈规则的单层扁平形，内膜层与中膜层分界清晰，中膜层VSMC形态规则，排列整齐(见图1A)。模型组血管内膜层显著增厚，内弹性膜消失，内膜层与中膜层分界不清晰，中膜层VSMC增生并向内膜移行，并见大量胶原纤维形成(见图1B)。葛低组可见血管内膜层相对完整，内膜层与中膜层分界相对清晰，中膜层VSMC增生明显(见图1C)。葛高组可见血管内膜层完整、清晰，内弹性膜明显，内膜层与中膜层分界相对清晰，中膜层VSMC形态规则，排列整齐(见图1D)。

2.2 原位杂交检测VSMC BIP mRNA表达 BIP mRNA信号表达细胞质阳性，细胞核阴性，提示该基因片段定位于细胞质。正常组VSMC细胞质中可见少量棕黄色颗粒表达，表明探针与VSMC细胞质中的BIP mRNA结合(见图2A)。模型组与正常组比较，VSMC细胞质中聚集的棕黄色颗粒增多，表明模型组兔AS病变组织VSMC BIP mRNA表达信号比正常组增强(见图2B)。葛低组与模型组比较，可见VSMC细胞质聚集的棕黄色颗粒减少，表明葛低组VSMC BIP mRNA阳性表达信号降低 (见图2C)。葛高组与模型组比较，可见VSMC细胞质聚集的棕黄色颗粒明显减少，表明葛高组VSMC BIP mRNA阳性表达信号明显降低(见图2D)。

各组VSMC BIP mRNA表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组、葛低组、葛高组BIP mRNA表达量高于正常组，葛低组、葛高组低于模型组，葛高组又低于葛低组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

注：A为正常组，B为模型组，C为葛低组，D为葛高组

图1 各组兔胸主动脉组织病理(HE染色，×100)

Figure1 The histopathology of thoracic aorta in various groups

注：A正常组可见少量BIP mRNA阳性表达信号；B模型组BIP mRNA阳性表达信号显著增强；C葛低组BIP mRNA阳性表达信号明显降低；D葛高组BIP mRNA阳性表达信号显著降低

图2 原位杂交检测各组兔胸主动脉上段VSMC BIP mRNA表达信号

Figure2 The expression signal of BIP mRNA which located in the cytoplasm of VSMC in the superior segment of thoracic aorta which detected by situ hybridization

2.3 Western blotting杂交检测VSMC BIP蛋白表达 Western blotting杂交结果显示，各组VSMC中均有BIP蛋白表达(见图3)，且BIP蛋白表达量间差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组、葛低组、葛高组BIP蛋白表达量高于正常组，葛低组、葛高组低于模型组，葛高组又低于葛低组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

注：A为正常组，B为模型组，C为葛低组，D为葛高组；BIP=免疫球蛋白重链结合蛋白

图3 Western blotting杂交检测各组兔胸主动脉上段VSMC BIP蛋白表达情况

Figure3 The BIP protein expression which located in the cytoplasm of VSMC in the superior segment of thoracic aorta which detected by Western blotting hybridization

Table1 Comparison of BIP mRNA and protein expression levels in VSMC of four groups

组别只数BIPmRNABIP蛋白正常组85238±426048±002模型组811542±852∗108±001∗葛低组88615±614∗△076±002∗△葛高组86728±551∗△▲072±002∗△▲F值15193158330P值00000000

注：BIP=免疫球蛋白重链结合蛋白；与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01；与葛低组比较，▲P<0.05

3 讨论

葛根通脉饮方剂经河南中医学院第一附属医院临床应用证明对AS所致的心脑血管疾病具有一定的治疗作用，且可以显著降低血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白B-100(apoB-100)、Hcy水平，提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，可改善颈动脉内-中膜厚度，稳定斑块，降低斑块积分，联合使用葛根通脉饮改善血脂的疗效优于常规治疗[9]。葛根通脉饮治疗AS取得了满意的疗效，具有较高的临床价值和社会效益。

葛根通脉饮方中葛根通畅血脉、升阳解痉为君药；山楂活血散瘀、化痰行气，赤芍、川芎行血活血，共助葛根散瘀通脉为臣；当归、淫羊藿、太子参补气养血，以达气帅血行、通而不滞之功，为佐药；炙甘草为使，调和诸药，补中益气。该方治疗AS及相关心脑血管疾病，具有良好疗效。药理学研究显示，葛根具有抗氧化、抗缺血、降血压、抗AS的作用，其君药重要成分葛根素能够抑制脂类过氧化、清除自由基、抑制醛糖还原酶活性，降低血小板表面活性，抑制血小板凝聚和黏附，能够保护血管内皮细胞[10]。研究显示，在体外建立Hcy诱导的人主动脉血管内皮细胞损伤模型，使用不同浓度葛根素作用后，能够拮抗Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡，其中GRP78/BIP基因低表达可能是其抗AS的作用机制之一[11]。淫羊藿具有补肾壮阳、祛风湿、强筋骨的功效，除去上述功能，现代药理学研究还发现淫羊藿也具有改善心脑血管疾病的功能，可以通过降低血脂，抑制细胞黏附分子1(ICAM-1)mRNA表达，促进VSMC凋亡以及抗血管氧化作用，抗高脂血症所致早期AS形成[12]。另有报道显示，淫羊藿苷通过抑制核因子κB(NF-κB)的活性明显地抑制兔主动脉粥样硬化进展，NF-κB作为一种重要的炎症前基因的早期的转录调控子，淫羊藿苷可抑制活化NF-κB，抑制生成活性氧基团，继而抑制细胞黏附因子和趋化因子的转录，从而干预AS的形成[13]。

大量的临床试验和流行病学研究证实Hcy是诱发心血管疾病的一个独立危险因子，可以通过损伤血管内皮细胞和促进VSMC增殖来促进AS的形成[14]，Hcy能够部分通过诱导细胞内的ERS而引起AS，Hcy引起的ERS级联反应表现为细胞内蛋白质合成受阻、ERS蛋白表达以及细胞凋亡事件的发生，其中BIP作为反应性基因，在Hcy激活的ERS过程中表达量上升，并通过内质网相关死亡途径引起细胞凋亡，其表达量在一定程度上反映了细胞ERS自我保护性反应的水平[15-17]。本研究通过高胆固醇高蛋氨酸饮食建立AS模型，蛋氨酸在酶的作用下可转化为Hcy，进而损伤动脉管壁内皮细胞，使胆固醇和TG沉积于动脉壁上，导致AS的形成。AS模型组兔胸主动脉病理组织学观察可见VSMC增生，内膜面积增加，还见到脂质沉积、斑块形成。葛高组兔胸主动脉组织血管内膜层完整、清晰，内弹性膜明显，内膜层与中膜层分界相对清晰，中膜层VSMC形态规则，排列整齐接近正常组。提示高同型半胱氨酸血症可引起血管内膜增厚、平滑肌细胞增生等早期动脉硬化改变，而葛根通脉饮对Hcy引起的血管病变可能有修复作用。

此外，本研究还对葛根通脉饮拮抗由Hcy诱导的兔AS模型中胸主动脉血管损伤的作用机制进行了探讨，发现葛根通脉饮通过综合调控ERS信号通路中BIP mRNA及其蛋白的表达量，来延缓或逆转AS的出现。原位杂交和Western blotting杂交结果均显示葛根通脉饮干预后BIP mRNA及其蛋白表达量低于模型组，且高剂量的葛根通脉饮作用更强。提示葛根通脉饮保护血管的机制之一是减轻ERS导致的细胞损伤，BIP mRNA是其一个重要的作用靶点；而高剂量葛根通脉饮对VSMC的保护作用优于低剂量的葛根通脉饮。

综上所述，本实验通过观察葛根通脉饮对Hcy损伤的血管内皮细胞ERS反应途径中的重要分子——BIP mRNA及其蛋白表达的调控作用，发现了葛根通脉饮拮抗血管内皮细胞损伤等抗AS药理学效应的分子机制和可能的作用靶点，为中药葛根的开发和AS的防治提供了理论线索和实验依据。而且，随着葛根通脉饮相关药理学研究的不断深入以及相关信号通路的不断探索，葛根通脉饮在心脑血管疾病中的作用机制也在不断被阐明，为促进我国传统中医药产业具有重大的推动作用。

1 张峰娟，边云飞，刘金帅.内质网应激与动脉粥样硬化的相关研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2011，9(1)：94-96.

2 Li Y，Zhang H，Jiang C，et al.Hyperhomocysteinemia promotes insulin resistance by inducing endoplasmic reticulum stress in adipose tissue[J].J Biol Chem，2013，288(14)：9583-9592.

3 孙飞，马向红，李广平，等.血浆同型半胱氨酸水平对原发性高血压患者发生冠心病的预测价值[J].中国全科医学，2012，15(5)：1469.

4 黄瑞，赵钢.血浆肝细胞生长因子和同型半胱氨酸与高血压病合并颈动脉粥样硬化的相关性[J].中国煤炭工业医学杂志，2012，15(1)：28-30.

5 丁晶，曾超美，杜军保.内质网应激与动脉粥样硬化[J].实用儿科临床杂志，2010，25(13)：1013-1016.

6 Tabas I.The role of endoplasmic reticulum stress in the progression of atherosclerosis[J].Circulation Research，2010，107(7)：839-850.

7 林丽，唐朝枢，袁文俊.内质网应激[J].生理科学进展，2003，34(4)：333-338.

8 赵君玫，魏群，毕红征，等.葛根素对兔血管内皮细胞凋亡及凋亡基因GRP 78表达水平的影响[J].时珍国医国药，2011，22(5)：1177-1179.

9 呼海涛，张妍，沈晓君，等.葛根通脉饮下调NF-κB 表达干预动脉粥样硬化[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(4)：179-182.

10 姚丹，丁选胜.葛根素药理作用机制探讨及临床应用[J].中国临床药理学与治疗学，2008，13(4)：468-474.

11 沈晓君，何航.葛根素对Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡及GRP78表达的影响[J].中药药理与临床，2009，25(4)：12-15.

12 王东芝，李东万，张守刚.淫羊藿在心血管疾病方面的研究进展[J].浙江中医药大学学报，2013，37(1)：107-111.

13 沈晓君，何航，冯黎.淫羊藿苷下调核因子NF-κB通路干预兔动脉粥样硬化机制研究[J].中国实验方剂学杂志，2009，15(9)：107-109.

14 王楠，冯娟，王宪.甲基化调控在高同型光胱氨酸血症致动脉粥样硬化中的作用[J].生理科学进展，2012，43(4)：267-271.

15 杨帆，谭红梅，王虹.血浆同型半胱氨酸水平升高与动脉粥样硬化[J].生理学报，2005，57(2)：103-114.

16 邓远琼，张志娟，李宏翔，等.血管内皮功能及同型半胱氨酸对冠心病的预测价值研究[J].中国全科医学，2013，16(11)：3672-3675.

17 张敏，李卫征.2型糖尿病合并脑梗死患者血清超敏C反应蛋白及同型半胱氨酸与颈动脉粥样硬化的关系[J].中国全科医学，2012，15(7)：2292.