归龙汤对糖尿病血管病变大鼠免疫机制的影响

魏丹蕾周毅业李思宁简小兵陶有青王文英符路娣赖圆瑾

（1广州市中医医院内分泌科，广州，510130；2广州中医药大学第一附属医院心血管科，广州，510405；3世界中医药学会联合会，北京，100101；4广州中医药大学实验动物中心，广州，510006；5广州中医药大学附属广州中医院内分泌科，广州，510130）

实验研究

归龙汤对糖尿病血管病变大鼠免疫机制的影响

魏丹蕾1周毅业1李思宁2简小兵1陶有青3王文英1符路娣4赖圆瑾5

（1广州市中医医院内分泌科，广州，510130；2广州中医药大学第一附属医院心血管科，广州，510405；3世界中医药学会联合会，北京，100101；4广州中医药大学实验动物中心，广州，510006；5广州中医药大学附属广州中医院内分泌科，广州，510130）

目的：探讨归龙汤对糖尿病血管病变大鼠免疫的影响。方法：将80只大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、西洛他唑组、归龙汤（低、中、高）剂量组，并造糖尿病血管病变大鼠模型。空白对照组和模型对照组的大鼠每日喂饲蒸馏水；西洛他唑组每日喂饲西洛他唑片1.67 mg/kg；归龙汤组予以不同剂量的归龙汤灌胃。用药56 d后，牺牲实验大鼠，测定大鼠血清中血糖及免疫指标的水平，同时取大鼠主动脉弓下段2～3 cm主动脉，在光镜下观察主动脉粥样硬化病变及其程度。结果：糖尿病血管病变大鼠的免疫指标中IgM、IgA和C3升高，IgG降低。低、中、高剂量的归龙汤均能使糖尿病血管病变大鼠的免疫指标恢复正常。结论：归龙汤能够有效调节糖尿病血管病变大鼠免疫失衡状态。

归龙汤；糖尿病血管病变；免疫；大鼠

糖尿病足是糖尿病的严重并发症，具有患病率高、危害性大、可防难治的特点，加强对糖尿病足的早期干预有着非常重要的现实意义［1］。大量的研究表明糖尿病及糖尿病足与免疫密切相关［2－4］，因此，通过调节糖尿病足患者的免疫状态，是防治该病的途径之一。为此，本研究建立糖尿病血管病变大鼠动物模型，用具有温阳养血活血作用的归龙汤对糖尿病血管病变大鼠进行干预，观察大鼠免疫相关指标：IgM、IgG、IgA、C3、C4的水平变化，探讨归龙汤对糖尿病血管病变大鼠免疫因素的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由广州中医药大学实验动物中心提供。SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量150～180 g，鼠龄6～8周。

1.2 药物与制剂

1.2.1 西洛他唑片 规格：50 mg/片（国药准字H20040579号，西安大恒制药生产）。

1.2.2 归龙汤 组成：当归尾10 g，赤芍15 g，桂枝10 g，地龙12 g，路路通12 g，细辛6 g，银杏叶12 g。制法：由广州市中医医院煎药室浓缩煎煮成汤剂，再分别配成含生药浓度为4 g/mL煎剂作归龙汤高剂量，含生药浓度为2 g/mL煎剂作归龙汤中剂量，含生药浓度为1 g/mL煎剂作归龙汤低剂量，然后放入4℃冰箱备用。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组 分为空白对照组（n＝10），模型对照组（n＝10），西洛他唑组（n＝15）、归龙汤低剂量组（n＝15）、归龙汤中剂量组（n＝15）、归龙汤高剂量组（n＝15）。

1.3.2 糖尿病血管病变大鼠模型制备 随机抽取70只大鼠给予高糖高脂饲料（普通饲料67.5%、蔗糖20%，精炼猪油10%、胆固醇2.0%、猪胆盐0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%），并给予10 mg/（kg·d）一氧化氮合成酶（Nitric Oxidesvnthase，NOS）抑制剂－N－硝基－L－精氨酸甲醋（L－NAME）灌胃；其余10只大鼠作为空白对照组予普通饲料饲养；每只大鼠共饲养28 d。第29 d，所有高糖高脂饮食大鼠禁食≥10 h后腹腔注射STZ 25～30 mg/kg，空白对照组大鼠注入同体积的柠檬酸钠缓冲液。注射后72 h，测各鼠FBG或OGTT－2hBG。FBG≥7.8 mmol/L或2hBG≥11.1 mmol/L的提示糖尿病大鼠造模成功。糖尿病大鼠按体重和血糖值分入模型对照组、西洛他唑组、归龙汤低、中、高剂量组，继续喂饲高糖高脂饲料及L－NAME灌胃，连续28 d，翌日检测所有大鼠的空腹血糖，同时抽取2只模型对照组大鼠并处死，取主动脉弓下段2～3 cm主动脉，用于观察主动脉粥样硬化病变及其程度，判断糖尿病血管病变大鼠是否成模。

1.3.3 糖尿病血管病变大鼠成模标准 从以下两方面判定糖尿病血管病变大鼠模型是否成功。1）血糖：FBG≥7.8 mmol/L或2hBG≥11.1 mmol/L。2）取实验大鼠主动脉弓下段2～3 cm主动脉，主动脉于10%中性甲醛溶液中固定48 h后进行脱水、石蜡包埋后切片作常规HE染色，在光镜下观察主动脉粥样硬化病变及其程度。光镜下如可见内皮细胞肿胀，其下聚集大量泡沫细胞，平滑肌细胞排列紊乱，弹力纤维断裂，血栓形成，证实动脉内膜粥样硬化典型病变。

1.3.4 给药方法 糖尿病血管病变大鼠成模后，空白对照组和模型对照组每日喂饲蒸馏水，西洛他唑组每日喂饲西洛他唑片1.67 mg/kg，归龙汤高、中、低剂量组每日分别给予高、中、低剂量的归龙汤4 mL灌胃，共用药56 d。

1.3.5 血清标本采集和检测 给药至第56天禁食≥10 h，第57天用血糖仪测全血FBG后，对照组和药物组分别静脉注射2.78 mol/L葡萄糖溶液或葡萄糖－药物混合液20 mL/kg后2 h，测2 hBG，随后喂食至22：00。全部实验动物禁食≥10 h，翌日取血，血标本于1 h内以3 000 r/min离心10 min，取血清保存于－20℃冰箱内待测，所有标本收集完成后同批测定以减少批间差异。采用常规生化、ELISA或RIA方法检测各组大鼠FBG，IgM、IgG、IgA、C3、C4。

1.3.6 统计学方法 采用SPSS 11.5数据统计软件进行数据处理，计量资料分别采用配对t检验和组间t检验或方差分析；计量资料采用χ2检验；等级资料采用秩和检验，分别统计实验数据的统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病血管病变大鼠造模成功后大鼠存活情况

按照实验设计，造模前，空白对照组和模型对照组分别入选10只，其他4组各入选15只。但由于本实验在糖尿病血管病变大鼠成模前未对高血糖等因素予以干预，在糖尿病大鼠或糖尿病血管病变大鼠成模前，除空白对照组外，其余5组均有实验大鼠死亡或被处死，故实际用药大鼠相应减少。实验不同阶段大鼠的数量详见表1。

表1 实验不同阶段各组内大鼠的数量（只）

表2 糖尿病大鼠成模时各组空腹血糖水平的比较（mmol/L）

图1 主动脉血管内皮细胞肿胀增生

图2 主动脉内血栓形成

表3 用药前后各组糖尿病血管病变大鼠空腹血糖水平的比较（mmol/L）

2.2 糖尿病血管病变大鼠模型评价

2.2.1 血糖水平评价 模型对照组、西洛他唑组、归龙汤低剂量组、归龙汤中剂量组、归龙汤高剂量组的空腹血糖均大于7.8 mmol/L，与空白对照组比较，明显升高，差异有统计学意义，但这5个组之间的空腹血糖差异无统计学意义，见表2。

2.2.2 主动脉粥样硬化病变及其程度 光镜下观察大鼠主动脉标本，可见内皮细胞肿胀增生，主动脉内血栓形成（见图1和图2），说明造模成功。

2.3 归龙汤对糖尿病血管病变大鼠FBG的影响 表3提示与空白对照组相比，其他各组在用药前和用药后的空腹血糖均明显升高，且有统计学意义，但西洛他唑组及归龙汤低、中、高剂量组的组内空腹血糖在用药前后差异无统计学意义，说明西洛他唑片和归龙汤都不具降血糖作用。

2.4 归龙汤对糖尿病血管病变大鼠免疫指标的影响

表4中模型对照组、西洛他唑组及归龙汤低、中、高剂量组与空白对照组的免疫指标比较后提示，糖尿病血管病变大鼠存在IgM、IgA和C3升高，IgG降低，C4变化不明显，大部分免疫指标的变化，说明糖尿病血管病变大鼠的机体存在免疫异常。经使用归龙汤后，归龙汤低、中、高剂量组的IgM、IgG、IgA和C3与空白对照相应的免疫指标的水平无统计学意义，说明低、中、高剂量的归龙汤均能使糖尿病血管病变大鼠的免疫指标恢复正常。使用低、中、高剂量的归龙汤均能降低IgM，这3组的IgM水平较模型对照组低，且差异有统计学意义。低、中、高剂量的归龙汤组均能升高IgG，与模型对照组的IgG比较，归龙汤中、高剂量组更为明显，且差异有统计学意义。归龙汤的不同剂量组均能降低糖尿病血管病变大鼠的IgA和C3，在降低IgA方面，与模型对照组比较有差异，且有统计学意义，但不同剂量的归龙汤3组间无统计学意义；与模型对照组比较，只有中、高剂量的归龙汤能够有效降低C3。与模型对照组比较，西洛他唑组的IgA有降低，且比较有统计学意义，但不能降低IgM、C3或升高IgG，说明西洛他唑片不能从总体上改善糖尿病血管病变大鼠免疫异常状态。

表4 各组用药后免疫指标水平的比较（g/L）

3 讨论

糖尿病与免疫的关系已有诸多的研究，免疫调节异常可能在糖尿病发生发展过程中起核心作用［5－7］。近来年随着对糖尿病足研究的深入，大量的研究表明糖尿病的血管病变与周围神经病变均与免疫密切相关［8－10］。糖尿病足患者可能存在免疫系统的损害，其表现为一种渗出性和坏死性炎症，全身及局部可能存在免疫失衡［11］。徐冬岩［12］研究显示单纯糖尿病组和糖尿病足部感染组血清lgG较健康老年人组明显下降，且以单纯糖尿病组下降更为显著，IgA和IgM水平在3组间无统计学意义。本课题组在前期研究中也发现：与单纯糖尿病患者及健康人比较，0级糖尿病足患者存在明显的免疫失衡状态［13］。这些研究提示我们改善糖尿病患足者免疫失衡状态，可以早期干预糖尿病足和预防糖尿病足溃疡的发生。

中医学认为阳气损伤是糖尿病足形成的重要病机［14］。归龙汤为当归四逆汤加味而成，其中当归四逆汤出自张仲景的《伤寒论》，当归四逆汤具有温经散寒、养血通脉功效［15］。归龙汤在当归四逆汤的基础上加银杏叶、地龙、路路通，去木通、甘草、大枣组成，诸药合用，活血通络而无伤阴之弊，寒温并用既不温燥耗津，又不寒凉留滞，共奏温阳养血，活血通络之功。

本研究证实具有温阳养血活血作用的归龙汤能够降低糖尿病血管病变大鼠的IgM、提升其IgG，有效调节了糖尿病血管病变大鼠免疫状态。

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（2014－08－01收稿 责任编辑：张文婷）

Effect of Guilong Decoction on Imm une M echanism of Rats w ith Diabetic Angiopathy

Wei Danlei1，Zhou Yiye1，Li Si'ning2，Jian Xiaobing1，Tao Youqing3，Wang Wenying1，Fu Ludi4，Lai Yuanjin5
（1 Guangzhou Hospital of TCM，Guangzhou 510130，China；2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3World Federation of Chinese Medicine Societies，Beijing 100101，China；4 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；5 The Affiliated Guangzhou TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China）

Objective：To investigate the effect of Guilong decoction on the immunemechanism of rats with diabetic angiopathy.Methods：Eighty rats were random ly divided into blank control group，model control group，cilostazol group，Guilong（low，middle，high dose）group.Models of ratswith diabetic angiopathy weremade.Rats in the blank control group and themodel control group were daily fed with distilled water.The cilostazol group daily fed ratswith 1.67 mg/kg cilostazol；Guilong decoction group gave different doses of Guilong decoction.After 56 days，the experimental ratswere killed，and the blood glucose and immune indices in serum of ratswere detected.The atherosclerotic aortic lesionswere observed under the microscope.Results：IgM，IgA and C3 immune indexes of diabetic angiopathy in rats were increased，IgG was decreased.The high，middle and low dose Guilong decoction could return the immune index in ratswith diabetic angiopathy to normal.Conclusion：Guilong decoction can effectively regulate the immune imbalance of ratswith diabetic angiopathy.

Guilong decoction；Diabetic angiopathy；Immune；Rats

R285.5；R587.1；R392.11

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.11.032

广东省科技计划项目（项目编号：2011B061300064）；广东省中医药局科研课题（项目编号：20111024）

魏丹蕾，广州市荔湾区珠玑路16号，Tel：（020）81226233，E－mail：939762912＠qq.com