葡萄糖氧化酶双试剂终点法测量模式的系统分析

高小文，孔花娟，李 筱，李雄海，柏 莹，陈文华（陕西省汉中市中心医院检验科 723000）

目前血清葡萄糖临床实验室测定有3种方法[1]：己糖激酶法、葡萄糖氧化酶法和葡萄糖氧电极法。另外还有床边式血糖仪[2]，在临床科室血糖监控中普遍应用。己糖激酶法是葡萄糖测定的参考方法[3]，但成本较高，临床实验室实际应用较少。葡萄糖氧电极法是近年来应用于临床的快速检测方法，自动化程度高，结果快速，需要特殊电极，成本较高，适合用于急诊项目，是未来血糖检测发展的方向，但实际应用不多。葡萄糖氧化酶法特异性不高，但在临床广泛应用于各诊断实验室，血清葡萄糖氧化酶法在终点法中具有鲜明的特点，能充分体现终点法全自动生化分析不同测量模式下的表现形式。然而各试剂供应商给各级医院提供的不同型号的全自动生化分析仪参数，普遍存在一些不合理的地方，加之设备厂家工程师对不同型号仪器参数设置也认识不够，导致仪器的某些参数设置形同虚设，起不到应有的作用，给临床个别标本的分析带来很大的误差，目前这一方面的问题报道较少[4]。本文以参数设置具有合理性和代表性的岛津CL－8000全自动生化分析仪为例，系统地分析了血清葡萄糖氧化酶双试剂终点法各种参数设置模式的优缺点，供临床实验室人员参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源 选用当天门诊患者血糖值在7.0、19.2、24.2 mmol／L的样品3份，在高值血清中加纯品葡萄糖粉自制1份特高值样品。

1.2 仪器与试剂 日本岛津CL－8000全自动生化分析仪。上海科华公司生产的双试剂葡萄糖氧化酶法试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 设置岛津CL－8000 5种模式相同的仪器参数 见表1。按表1所要求的不同条件，以每一个模式为一个测试项目，设置岛津CL－8000生化分析仪的相关参数，5种模式相同的参数设置是：在Ready状态下，进入Environment中将Automatic Rerun／Adding选为On，即打开自动重做功能。在Ready状态下，进入Request将Automatic Rerun／Adding选中，此时凡符合自动重做条件的实验项目即执行自动重做功能。在Ready状态下，按照Parameter Test Master photometry选中项目GLU，进入Detail设置好样品类型，单位，小数点，方法类型，波长；再进入Reagent Condition页面进行试剂量的设定；进入Calibration页面进行标准位置，定标类型等参数相关设定。然后进入Sampling Condition页面进行样品参数设定，在Sample vol 1中输入4μL，2中输入2μL；在Condition一栏中选中First Run，执行1；选中Above V－Range执行2；选中Super High执行2；选中Over Absortance执行2。再进入Range：Limit Condition页面进行正常范围，线性范围，反应方向等参数的设定，尤其在Technical Limit选项中先选中Above再在Limit输入限定的最高吸光度值。

表1 岛津CL－8000对葡萄糖的不同标本处理分析

1.3.2 设置岛津CL－8000 5种模式不同的仪器参数 模式1在Limit Condition页面进行线性范围设置时，设为0～24；在Technical Limit选项中在Limit项中输入限定的最高吸光度值为1 100mAbs。模式2仅在模式1的基础上将反应终点从33点延长到50点，使反应达到充分完全。模式3在Limit Condition页面进行线性范围设置时，设为试剂说明书提供的0～27.8的数据；在Technical Limit选项中在Limit项中输入限定的最高吸光度值为2 500mAbs。另外在Sampling Condition页面进行样品参数设定时，在Sample vol 1中输入4μL，在Condition一栏中选中First Run，执行1，其余不设置。模式4仅在模式1的基础上在Technical Limit选项的Limit项中输入限定的最高吸光度值为2 500mAbs，使线性范围最高值24成为有效的限制参数。模式5在模式1的基础上在Limit Condition页面进行线性范围设置时，设为试剂说明书提供的0～27.8；使Limit项中输入限定的最高吸光度值1 100mAbs为有效的限制参数。

1.3.3 用5种模式对4种不同的样品进行分析 将4种不同的样品放置在样品盘上，对每一份样品均采用以上5种模式进行分析，直到样品状态显示完成为止。每一份样品重复测3次，结果取均值。

2 结 果

2.1 对自制特高值血清标本，观察和评价5种模式具体的数据和反应曲线，结果见表2。模式1、4、5的限制参数均发挥作用，提示出超限，并执行2的减量测定，结果理想，同时各种模式对此标本均表现出底物耗尽现象，但模式2和模式3未发现和提示出此种现象，存在参数缺陷，实际测定数据误差也较大。

表2 不同模式对特高浓度血糖测定的结果（mmol／L）

2.2 选出血糖值在7.0、19.2、24.2mmol／L水平的样品3份，每一份样品重复测3次，测试结果取均值见表3。数据显示7.0mmol／L和19.2mmol／L的标本5种模式均能准确测定。24.2mmol／L标本模式3存在参数缺陷，导致结果误差较大。

表3 不同模式对不同浓度血糖测定的结果（mmol／L）

3 讨 论

目前临床生化检验自动化程度越来越高，几乎全部采用各试剂厂家的成品试剂，但是我国体外诊断试剂的现状与国际上相比，无论质量还是监管都有一定的差距[5]，提供的实验参数缺乏科学性，如焦连亭[6]报道的如果对分析化学、酶动力学和对仪器性能没有一定的掌握，是很难设置好参数的。要根据各实验项目在临床上的具体情况，各种仪器的性能特点，合理设置。这就要求设备厂家工程师对设备的各种参数和性能必须熟悉，并得到恰当的应用。同时试剂厂家对所生产的试剂一定要作出科学的评价，尤其是试剂吸光度A值的最低和最高检测限额以及空白A值、线性范围等限制参数必须与实际情况相符。

在仪器方面，有些仪器为了提高检测速度，样品在第一次加样后即退出轨道，仅对结果的高值和超限提出报警，由实验人员对标本进行稀释重测。有些仪器考虑到标本的稀释重做，采用圆盘式样品加样，同时增设自动稀释重做功能，能很好地完成对每一份样品的测定，具有代表性的就是日立和岛津系列。

在终点法的设置时，有些项目反应很快达到终点，显色稳定。比如三酰甘油、总胆固醇、尿酸等，可以缩短读点。但有的项目反应慢，在仪器的一般设定时间内，达不到终点，特高值样品显色后又不稳定，表现出底物耗尽现象。对此类试验一方面除尽可能地延长反应时间，让反应达到完全外[7]，还应注意到底物耗尽的现象，尤其以葡萄糖氧化酶法测定最具代表性。越是特高值的样品，底物耗尽现象引入的误差越大，此种情况在糖耐量实验中表现最为突出。也有对葡萄糖氧化酶法一点终点法进行改良的报道[8]，即在不改变样品与试剂比例的前提下，将样品与试剂各减半混合，在仪器测光前（终点前）加入等量的水稀释混匀，再测定其吸光度。测定线性范围较宽，一般不需对高浓度标本进行稀释。还有将终点法改良为两点法的报道[9]。

本组研究设置模式2，以实现延长反应时间，使反应达到终点的目的，同时对线性高值和吸光度A值最高限额进行了有效限制。对正常标本和稍高值的标本效果很好，但在对特高值样品测定时，发现反应曲线呈抛物线状降低，表现出底物耗尽的现象，并引入较大的误差，应引起同行的重视。在本研究设置的模式4中单独对线性高值进行了有效限制，使超出线性范围的标本均起到了报警和自动减量重做的作用，结果的准确性得到了保证。在设置的模式5中单独对吸光度A值最高限额进行了有效限制，同样对超限标本均起到了报警和自动减量重做，进一步验证了在日常工作中采用的模式1的科学性和正确性。模式1也是目前作者认为在实际应用中最为理想的分析模式，它充分利用了有效的线性限制和吸光度A值最高限额，对不同浓度的标本均能实现准确测定。对于模式3设置的线性限制和吸光度A值最高限额，均未起到任何限制作用，从本次葡萄糖氧化酶法结果分析，反映出试剂厂家提供的线性范围为27.8mmol／L，而实际在24.5mmol／L左右已达到线性极限，同时试剂厂家提供的吸光度A值最高检测限额ABS＝2 500mAbs，在CL－8000上仅测到1 300～1 400mAbs，导致模式3所设置的限制参数起不到任何作用，给高值样品的检测带来很大的偏差[10]。这种模式个别工程师经常用，应引起注意。

因此要求广大的临床检验人员，在实际工作中不要一味依赖厂家提供的各种参数，要正确分析，合理利用厂家提供的限制参数和试剂比例[11]，注意一些干扰因素[12]，确保对各种标本分析结果的准确性。

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