蜂胶与柠檬提取物混合液对变形链球菌作用的体外研究

杨清岭，连 爽，赵 王月，李宝花，莫文静

(佳木斯大学附属第二医院儿童牙病科，黑龙江 佳木斯 154002)

龋病是人类最常见的口腔疾病，其中与龋病密切相关的变形链球菌是口腔中最常检出的致龋菌，它能发酵出多种碳水化合物产生乳酸，其产酸力、速度、耐酸性均强于其他口腔链球菌，可在pH低至4.2的环境中生存。它的致龋因素主要在于对牙面的黏附、聚集、产酸以及耐酸，乳酸脱氢酶将细菌代谢的中间产物丙酮酸还原成乳酸，造成牙面的酸性环境，而这些是龋病发生的首要条件，因此本实验重点研究混合液对变形链球菌生长、产酸的作用，且进一步探讨混合液对变形链球菌代谢产酸的机制。近年来，天然提取物因来源丰富、取材方便、疗效好、副作用轻微而引起人们的关注。鉴于蜂胶是一种天然的生物材料，具有广泛的药理作用，抑菌效果好、毒副作用小，但有一定的苦涩感；柠檬提取物有很强的生物学活性，其主要成分具有较强的抗炎活性，能抑制细菌、真菌、病毒的生长繁殖，没有毒副作用，而且口感芳香。本实验研究探讨将这两种天然物质联合应用于防龋，为两者混合液防龋的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

蜂胶(水溶性，纯度98%)，柠檬提取物(精细粉末，100%通过80目)(购于西安森卓生物科技有限公司)；变形链球菌(菌株编号为ATCC25175，由四川大学华西口腔医学院提供)；BHI琼脂培养基，BHI液体培养基(购于杭州天和微生物试剂有限公司)；漱爽复方氯已定含漱液(哈尔滨乐泰药液有限公司)；噻唑蓝MTT(上海金穗生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)。

1.2 变形链球菌菌悬液制备

将冻干保存的菌种S.m于液体BHI培养基中复苏，37℃厌氧培养24h，经革兰染色镜检为纯培养后，用比浊仪调整菌悬液浓度至0.5 McFarland(108CFU/mL) 。

1.3 实验药液的制备

将固体水溶性蜂胶溶解于无菌液体BHI中，搅拌使其充分溶解，滤去未溶解部分蜂胶，经计算配置成100mg/mL蜂胶母液，用BHI液体培养基将蜂胶稀释成以下浓度0.78、0.5、0.39、0.2、0.1mg/mL；同理制备100mg/mL柠檬提取物母液，用BHI液体培养基将柠檬稀释成以下浓度：12.5、10、6.25、3.13、1.56mg/mL。

1.4 混合液对变形链球菌生长的影响

1.4.1 确定蜂胶、柠檬单组份的MIC值

用MTT法测蜂胶、柠檬各浓度组OD值，并计算抑菌率，当抑菌率达到80%时的最小浓度即为其MIC值。本实验设阳性对照组(氯已定加菌液)、阴性对照组(液体培养基加菌液)、空白对照组(液体培养基)。抑菌率=(阴性对照OD值-实验OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)×100(%)。

1.4.2 确定混合液的MIC值

MTT法测蜂胶、柠檬各浓度组混合液的OD值，在96孔板上每一横排分别加入0.78、0.5、0.39、0.2、0.1mg/mL蜂胶溶液100μL，纵排加入12.5、10、6.25、3.13、1.56mg/mL柠檬提取物溶液100μL，此时蜂胶浓度为0.39、0.25、0.2、0.1、0.05mg/mL，柠檬提取物溶液浓度为6.25、5、3.13、1.56、0.78mg/mL。两溶液充分混匀后，每孔分别加入准备好的菌液20μL，并设置阳性对照、阴性对照、空白对照。于37℃(90%N2,10%CO2)厌氧培养24h，用酶标仪测量OD值并计算，当抑菌率达到80%时的最小浓度为其MIC值，实验重复3次。

1.4.3 联合用药效果评价

根据单独用药和联合用药的抑菌效果，计算分级抑制浓度(FIC)指数，从而检测两者的抗菌作用关系。FIC=蜂胶联合时MIC/蜂胶单独时MIC+柠檬联合时MIC/柠檬单独时MIC。当FIC≤0.5时为协同作用，0.52时为拮抗作用。

1.5 蜂胶-LPE对S.m产酸能力的影响

利用二倍稀释法配置如下四个浓度：1/2、1/4、1/8、1/16MIC(设空白对照组)，按菌液与药物混合液1：10(v/v)比例接种S.m，37℃厌氧培养24h，离心(1500r/min,20min)取上清液，用pH计测定pH，重复测定3次，取平均值，计算pH的变化：△pH=初始pH(7.4)-终末pH。

1.6 蜂胶-LPE对S.m乳酸脱氢酶活性的影响

利用二倍稀释法配置如下四个浓度：1/2、1/4、1/8、1/16MIC(设空白对照组)，按菌液与药物混合液1：10(v/v)比例接种S.m，37℃厌氧培养24h，离心(3300r/min,20min)，取上清液备用。每管中的上清液利用二硝基苯肼法测乳酸脱氢酶活性。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 变形链球菌分别在不同浓度蜂胶溶液和LPE中的生长情况见表1、2。

蜂胶溶液和LPE抑菌率在80%以上的最小浓度分别为0.39mg/mL和6.25mg/mL。根据实验结果判定蜂胶MIC值为0.39mg/mL，LPE的MIC值为6.25mg/mL。

表1 不同浓度蜂胶溶液对S.m的抑制情况

注：各实验组与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05)

表2 不同浓度LPE对S.m的抑制情况

注：各实验组与阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05)。

2.2 变形链球菌在不同浓度蜂胶溶液和 LPE混合液中的抑制情况

由表3可以计算出抑菌率：蜂胶0.2mg/mL，LPE5mg/mL时为82.72%，蜂胶0.25mg/mL，LPE1.56mg/mL时为84.28%，均可以达到抑制S.m的MIC值。蜂胶与LPE联用时，其MIC值为0.2mg/mL，LPE与蜂胶联用时，其MIC值为1.56mg/mL，根据公式计算得FIC=0.75。表明蜂胶与LPE联用时为相加作用。

表3 蜂胶-LPE混合液抑制S.m OD值

2.3 混合液对S.m产酸能力及乳酸脱氢酶活性的影响

选用蜂胶0.2mg/mL，LPE5mg/mL作为两者联合应用时的MIC值，以二倍稀释法配制低于此MIC的4个浓度梯度混合液，其对S.m产酸能力及抑制LDH活性，见表4。结果显示：S.m的产酸能力及抑制LDH活性随混合液浓度的增加而明显降低。各浓度组与阴性对照组均有统计学差异(P<0.05)。

表4 蜂胶-LPE混合液对S.m产酸的影响

注：各实验组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

研究表明变形链球菌是主要的致龋菌。耐酸性是变形链球菌致龋的重要毒力之一，进食碳水化合物后，口内菌斑变化范围很广，Stephen曲线表明，菌斑pH可以在20min内从7.0迅速下降至3.0～4.0。在胞外pH为4.0时，变形链球菌仍有质子流动和合成ATP，糖酵解继续进行，这保证了变形链球菌的高耐酸性，且在低pH下耐酸性反而增强，这使得变形链球菌在低pH环境下更具致龋性和生存优势。利用碳水化合物发酵产酸产生乳酸是致龋菌的重要特征，抑制变形链球菌乳酸脱氢酶活性，减少细菌产乳酸量，改变牙菌斑的酸性环境，是控制龋病发生的途径之一。许多学者已进行过不少防治龋病的药物研究，发现抗生素类、氯已定及其相关化合物对龋病有较好的防治作用，但是抗生素毒副作用过大及细菌产生耐药性的问题因而最终难以在龋病预防中推广。变链菌有抑制作用。然而，使用单味药抗菌，其单纯的抑菌或杀菌作用，可能对口腔因而本实验研究将蜂胶与柠檬提取物联合应用于防龋，探讨这两种物质的混合液的抗菌机制，为临床应用提供实验依据。

蜂胶抗菌有效成分为黄酮类化合物、松属素、高良姜素等，蜂胶的抗菌作用原理十分复杂，Popova等研究发现: 黄酮类成分能够分解细菌胞膜的能量，限制细菌的运动；Marcucci MC等发现:蜂胶对不同细菌和霉菌不但具有直接抑制作用，而且能够抑制细菌对细胞的黏附。柠檬提取物是从水果皮中提取出来的,有50多种有效成分,橘皮含有橙皮素、橙皮苷、橘橼酸及还原糖、挥发油、α-蒎烯、β-水芹烯。研究报告指出,柠檬提取物的主要成分为橘皮苷和橙皮素都能被肠胃吸，且表明柠檬提取物具有良好的生物安全性，能有效抑制口腔主要致龋菌的生长，是具有潜力的防龋药物。本实验通过测量两种药物单独作用时的MIC值，和联合应用时的MIC值，经过计算和对比，两提取物联合应用防龋，达到了降低单组分的使用剂量和毒副作用。

[1]张向宇,郭卯丁,李晓眠.柠檬提取物抗变形链球菌附着作用的研究[J].现代口腔医学杂志,2008,22(6):587-589

[2]林静,朱明,李新尚.没食子鞣质及联合氟化钠对不同状态下变形链球菌乳酸脱氢酶活性影响的研究[J].口腔医学杂志,2011,31(5):257-260

[3]黄晓晶,卢国英,刘建党.茶多酚与葡萄柚提取物联合应用对变异链球菌生长、产酸的影响[J].第三军医大学学报,2011,33(1):58-60

[4]Sonmez S, Kirilmaz L, Yucesoy M.The effect of bee propolis on oral pathogens and human gingival fibroblasts[J].Journal of Ethnopharmacology，2005，102(3):371-376

[5]Ophori EA, Eriagbonye BN, Ugbodaga P.Antimicrobial activity of propolis against Streptococcus mutans[J].African Journal of Biotechnology，2010，9(31):4966-4969

[6]Moraes RR,Brandt WC,Naves LZ,et al.Light-and time-dependent polymerization of dual-cured resin luting agent beneath ceramic[J].Acta Odontol Scand,2008,66(5):257-261

[7]李苹苹,林居红,刘明芳.水溶性蜂胶对致龋菌菌斑生物膜形态和产酸的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2010,20(7):277-279

[8]杨德琴,刘天佳,李颂.变形链球菌临床分离株乳酸脱氢酶遗传多态性研究[J].四川大学学报,2006,37(5):781-784

[9]孙志滢,张向宇,郭红.柠檬提取物漱口液对早期牙菌斑细菌构成的影响[J].实用口腔医学杂志,2011,27(1):123-124