三 种 色 谱 前 处 理 方 法 的 比 较

陈明星， 关 妍， 潘 伟， 章 斐， 邹 洪

(1.北京大学 化学与分子工程学院，北京 100871; 2.首都师范大学 化学系，北京 100048)

0 引 言

仪器分析教学中，理论和实际操作相结合的教学方法对于学生掌握各种分析测试技术和方法是非常重要的，当前，很多高校仪器分析理论教学多采用CAI(多媒体计算机辅助教学)的方式，将分析仪器的原理，构造等生动的表现出来[1-3]。除了理论教学以外，仪器分析实验在整个仪器分析教学过程中占有很重要的位置，起到很重要的作用，仪器分析实验的过程，也就是理论联系实际的过程[4-7]。

在具体实施过程中如何让学生深入的理解和掌握课堂上的理论知识，答案是显而易见的，那就是：设计出一种合适的实验教学方法。

色谱技术是生命科学、材料科学、环境科学等必不可少的手段和工具。根据最近的统计在全世界各类分析仪器中气相色谱仪和液相色谱仪的营销总额占25%～30%[8],色谱分析的全过程主要包括三个步骤：样品的采集处理、样品中各组分的分离测定、样品测定后数据的处理与结果的表达。其中样品的采集处理步骤是一个非常重要的和复杂的过程。据统计，在大部分色谱分析实验室中，样品的前处理所占用的时间占分析测试过程总时间的60%～70%，而色谱仪器测定分析样品的时间只约占10%，其余的时间是用于样品测定结果的整理和分析等[9]。而且样品前处理的好坏直接影响到后续的测试结果，因此，样品前处理这一项在色谱的实验教学过程中是绝对不能忽略的。

在工作中以及经过调研后发现，受色谱教学实验条件以及时间等因素的限制，目前本科生色谱实验教学过程偏重于分离、仪器操作和数据处理方面的练习[10-14]，没有涉及到前处理这一项，从而使得学生只有理论知识，缺乏实际操作经验。造成学生对色谱前处理概念淡薄，重视程度不够，还有相当一部分学生不知道如何去进行样品前处理。为了解决这个问题，有必要开发建立一种包含色谱前处理技术并适合教学的实验方法。

常用的色谱前处理方法包括溶剂萃取(液液萃取、液固萃取、液气萃取)、蒸馏、固相萃取、微萃取(固相微萃取、液相微萃取、毛细管固相微萃取)、超临界流体萃取、衍生化技术、微波萃取等。其中，溶剂萃取和固相萃取方法重现性好，易于操作，被采用的最多，也最为普及。微萃取技术，尤其是固相微萃取以其操作简单，样品用量少、无需使用溶剂、萃取后可直接色谱进样等诸多优点，发展很快，但是由于重现性相对较差，设备装置价格比较昂贵，成本较高，尚未普及。而超临界流体萃取、衍生化技术和微波萃取等前处理方法主要针对于一些特殊样品，不适合用于本科生教学实验。

本实验从本科生实验教学角度出发，利用液液萃取、固相萃取、液相微萃取三种常见前处理方法，以水中的邻苯二甲酸酯类物质为研究对象，结合气相色谱-质谱联用仪，考察了影响萃取效果的主要因素，优化了萃取条件，对三种常用的色谱前处理方法的处理效果以及特点进行了比较研究。

邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAEs，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。常用作增塑剂和软化剂，PAEs与塑料本身很难牢固结合，很容易从中溶解出来，从而进入环境。也是环境激素类物质[15],含较弱的雌性荷尔蒙活性成分，在人和动物体内起着类似雌性激素的作用，可导致内分泌紊乱、生殖机能失常等，过多地暴露在PAEs 中可能会导致男性比例下降、女性早熟以及乳腺癌[16]。水中PAEs主要来源于生产和使用PAEs的工厂,农用塑料薄膜、驱虫剂及塑料垃圾等经雨水淋洗、土壤浸润等,也会导致PAEs进入水体[17]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Agilent 7890A/5975C气相色谱质谱联用仪(DB-5MS 30 m×0.32 mm i.d.×0.25 μm石英毛细管柱)，Agilent BondElut Plexa C18固相萃取小柱(3 mL，200 mg)，VORTEX-GENIE2震荡混合器，Merk MILIPORE MILIQ-A超纯水机，SUPELCO 12位固相萃取装置，八方世纪BF-2000氮气吹干仪。

1.2 主要试剂与材料

邻苯二甲酸二甲酯(DMP) ，邻苯二甲酸二乙酯(DEP) ，邻苯二甲酸二丁酯(DBP) ，邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP) ，邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP) ，邻苯二甲酸双(2-乙基己基) 酯(DEHP) ，均购自百灵威公司；甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯均为一级色谱纯。

实验中使用的所有玻璃器具，为了避免实验室内空气中邻苯二甲酸酯的污染，将器具在预先配置的铬酸洗液中浸泡数小时，蒸馏水洗净，再用色谱纯甲醇淋洗3遍后在烘箱中以100 ℃烘烤5 h，实验过程中不使用塑料制品。

1.3 实验条件

1.3.1仪器条件

色谱条件：进样口温度280 ℃；传输线接口温度：280 ℃；程序升温：80 ℃(1 min)-10 ℃/min-320 ℃(5 min)；质谱条件：选择离子(SIM)扫描模式；质量数扫描范围：10～500 amu；离子源温度：230 ℃；四级杆温度150 ℃。

1.3.2标准溶液的配置

准确称取DMP，DEP，DIBP，DBP，BBP,DEHP,DNOP各5 mg，分别用甲醇溶液溶解在5 mL的容量瓶中，配成1 mg/mL的单标储备液。

准确移取上述6种单标储备液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成0.1 mg/mL的混合标准储备液，置于冰箱中保存备用。

将以上配好的混标稀释成0.05、0.02、0.01、0.002、0.001,0.000 5、0.000 25、0.000 125、0.000 01 mg/mL，进行仪器分析，绘制标准曲线。

1.3.3空白添加

取配好的混标溶液1 mL，放入1 000 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀密封冷藏待用。

1.3.4液相微萃取

用气相色谱专用微量注射器(Agilent 10 μL)吸取1 μL正己烷，插入装有1 mL空白添加水样并密封的样品瓶中，然后将微量注射器活塞推压至底部，使注射器内的有机溶剂形成一个液滴悬浮在枕头的顶部，进行萃取。萃取结束时，将针头的液滴抽回到微量注射器中，再拔除微量注射器并直接进行气相色谱质谱测定。萃取时间分别为3、5、8、10、15、20、30、40 min考察不同萃取时间对萃取效果的影响。

1.3.5液液萃取

考察乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷三种有机溶剂提取效果，取配好的空白添加溶液，加入5 mL上述有机溶剂，分别震荡提取5、10、15、30、45 min，静置分层后，吸取有机相，用氮气浓缩仪浓缩至1 mL进行气质联用仪分析，每个样品平行做三次。

1.3.6固相萃取

采用固相萃取技术对水样品进行预处理，采用的固相萃取小柱是Agilent Bond Elut Plexa C18(3 mL，200 mg)。取C18固相萃取小柱，分别加入10 mL色谱纯甲醇，自然缓慢通过萃取小柱，进行小柱的活化、去除杂质。

对固相萃取柱活化后，加入10 mL空白添加水样，上样结束后用平稳气流通过萃取柱15 min，使萃取柱充分干燥。用甲醇作为洗脱溶剂，洗脱体积为5 mL，用氮吹仪浓缩至1 mL进行气质联用分析。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与线性范围

在选定的仪器条件下，7种物质达到很好的分离，其选择离子色谱图如图1所示，根据色谱图可知各物质出峰时间，7种物质具体信息如表1所示。

图1 七种邻苯二甲酸酯总离子流图

表2中列出了7种物质的线性方程以及线性范围，可以看出，对于DMP,DEP,DIBP和DBP四种物质来说，有较宽的线性范围，而BBP,DEHP和DNOP来说线性范围相对较窄。

表2 七种邻苯二甲酸酯类物质的线性方程

2.2 液相微萃取

实验考察了正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷三种有机溶剂进行萃取，结果表明，乙酸乙酯虽然萃取率高，但是在水中形成的有机液滴非常容易从针尖脱落，而正己烷和二氯甲烷相对来说要容易的多，考虑到二氯甲烷萃取率相对较低，实验选择正己烷作为液相微萃取的萃取剂。以萃取时间和对各物质峰面积作图，如图2，可以看出20 min的萃取时间是最佳萃取时间。

图2 不同萃取时间的影响

2.3 液液萃取

考察正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷三种溶剂萃取效果得知，对于DMP、DEP、DIBP、DBP、DEHP五种物质，15 min左右达到萃取平衡。对于BBP、DNOP两种物质，30 min左右达到萃取平衡。计算萃取效率，结果见图3， 由图3可知，三种溶剂萃取效率均在85%以上，乙酸乙酯和正己烷比二氯甲烷高。考虑到实验的一致性，方法选用和液相微萃取一样的溶剂正己烷。

图3 不同萃取溶剂萃取效率比较

2.4 固相萃取

考察不同上样和洗脱流速对于萃取效果的影响，上样流速分别为5，10，20，30 mL/min；洗脱速率分别为5，10，20 mL/min，做正交实验。结果表明上样速率为10 mL/min，洗脱速率5 mL/min时萃取效果最佳。

2.5 三种提取方法的比较

三种提取方法提取效率如图4所示，单就萃取效率来看，固相萃取是三种方法中最低的；综合来说，三种不同的前处理方法各有特点，都是操作性比较强的前处理方式，液液提取操作简单，萃取效率最高，最容易被采用，但是使用溶剂量比较大，而且在萃取过程中，容易发生乳化现象，影响萃取效果，干扰也较大。液液微萃取操作简便，所用溶剂量小，成本最低，但是对人员操作技巧较高，需要反复练习才能达到比较好的效果。而固相萃取相比于液液萃取和液相微萃取来说，成本稍高，需要专门的萃取装置才能进行，萃取率比以上两种萃取方法稍低，但是固相萃取能有效地减少杂质的干扰。

图4 三种前处理方法萃取效率比较

3 结 语

本方法结合实验教学，从前处理方法，仪器条件摸索到后续的分析，通过对气相色谱、质谱以及气相色谱质谱联用技术进行深入的训练，使学生系统的理解和掌握了这门分析测试技术，很好地体现了理论和实际相结合的教学方法。

所采用的三种前处理方式都是属于比较容易操作的，没有涉及很复杂的设备或者操作，成本较低，在教学允许范围内，时间安排上也比较合理，综合来看可行性非常高。

从设计思路上来说，计划开发出适合教学的一系列实验方法，继本实验之后，会开发出检测实际样品的实验方法，便于学生全面深入掌握此项技能。需要注意的是，用邻苯二甲酸酯类的物质作为检测对象时，一定要避免使用塑料制品，避免污染。

本实验所建立的方法对于实际的样品检测也具有非常实用的价值。还可作为本科生教学实验和公共仪器平台中对科研用户进行仪器操作培训的方法。

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