嗜酸乳杆菌直投式发酵剂的制备及工艺条件的优化

王金菊，杨加怀，蔚钏，王艳萍

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457）

乳酸菌发酵剂是指用于酸奶、发酵豆乳、干酪及其他发酵制品生产用的乳酸菌培养物。发酵剂的研究经历了天然发酵剂（即自然发酵）到继代式发酵剂（即传统液体发酵剂）再到直投式发酵剂的发展阶段[1]。天然发酵剂的菌种复杂，易产生多种风味物质，发酵产品风味独特，但同时存在太多不确定因素，产物难以控制，产品中的腐败细菌还会降低产品的贮藏稳定性[2]。继代式发酵剂由于在生产发酵制品时，菌株需要母发酵剂经过活化、扩培，到中间发酵剂，从而制成大产量的工作发酵剂，生产过程复杂，技术要求极为严格，菌株易退化，还容易被杂菌污染，导致成本高、制备工艺繁琐、产品质量难以控制，从而影响产品品质[3]。

在人们迫切需要一种高效的发酵剂的背景下，直投式发酵剂应运而生。直投式乳酸菌发酵剂是指经筛选的优良的发酵用乳酸菌不经过复杂的前期活化、扩培过程，可直接进行产品发酵的发酵剂，这种发酵剂是发酵用菌株经过高度浓缩，再与保护剂充分混合后，再经干燥技术干燥后而得到的培养物[4]。

经此工艺制备的发酵剂，与传统继代式发酵剂相比：菌体浓度高，可减少用量；占用空间小，便于运输；保存时间长，在4 ℃条件下可保存一年以上；发酵能力强，可直接投入到原料中进行发酵而不需要复杂的活化过程，操作简单，减少活化过程中感染杂菌的机率，同时也可降低对于生产条件的要求[5]。

直投式发酵剂经过标准化流程生产，菌株组成稳定，发酵出的产品品质统一，同时由于减化了活化环节，可相应减少工厂在菌种车间的投资和空间以及菌株的污染机率，使发酵的生产更加专业、规范和统一，非常适合工业化生产，进而使发酵产业标准化。

1 材料与方法

1.1 菌种

嗜酸乳杆菌W-536（Lactobacillus acidophilus W-536）（以下简称W-536 菌）由天津科技大学食品生物技术研究室保藏。

1.2 主要试剂及培养基

脱脂奶粉：天津雀巢有限公司，其它试剂皆为国产生化试剂。

MRS 培养基：蛋白胨1.0 g，牛肉膏1.0 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖2.0 g，吐温80 0.1 g，K2HPO40.2 g，乙酸钠0.5 g，柠檬酸铵0.2 g，MgSO40.02 g，MnSO40.005 g，蒸馏水定容到100 mL，pH6.2～6.4，121 ℃灭菌20 min。

菌落计数培养基：在MRS 液体培养基中加入2.5%琼脂粉，121 ℃灭菌20 min。

1.3 主要仪器与设备

Avanti J-E 型柜式冷冻离心机：美国Beckman；三洋MPF-U4086S 型超低温冰箱：日本三洋株式会社；Nikon 光学显微镜YS-100：日本尼康；高压干燥灭菌锅：日本Yamato 公司；YC-015 喷雾干燥机：上海雅程仪器设备有限公司；扫描式电子显微镜：日本日立公司。

1.4 试验方法

1.4.1 直投式发酵剂干燥方式的确定

目前制备直投式发酵剂的两种主要干燥方式为喷雾干燥技术和冷冻干燥技术，真空冷冻干燥技术所用设备昂贵而且能源消耗也高，其制备的直投式发酵剂的成本较高。与真空冷冻干燥技术相比，喷雾干燥技术因其具备设备低廉、能源消耗低、易于推广、有利于大规模连续生产等优点，受到了研究者们越来越多的关注。故本研究选择喷雾干燥技术来制备嗜酸乳杆菌直投式发酵剂。其主要的制备工艺如下：

高密度乳酸菌发酵液→离心收集菌体→加入保护剂→喷雾干燥

1.4.2 直投式发酵剂制备工艺的优化

1.4.2.1 抗热保护剂的确定

1）单因素试验

嗜酸乳杆菌抗热能力较差，因此要选择合适的抗热保护剂在喷雾干燥过程中对其进行保护。目前常用的保护剂主要有糖类、多元醇类、氨基酸类、感胶离子盐类、蛋白质及肽类，本试验中的保护剂以脱脂奶粉为基础保护剂，再分别加入谷氨酸钠、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、β-糊精、多孔糊精、海藻酸钠、明胶。通过水浴模拟试验[6]，对这几种抗热保护剂的抗热能力进行研究。方法为：取10 mL 高密度乳酸菌发酵液加入10 mL 保护剂，混匀后，沸水浴30 min，测定混合液中的活菌数。其中保护剂的制备方法为：8%保护剂和20%脱脂奶粉溶于蒸馏水中，115 ℃灭菌20 min。

2）抗热保护剂的正交优化试验

采用正交试验设计L9（33）优化单因素试验结果中抗热效果较好的蔗糖和糊精，以及脱脂奶粉这三个因素，每种因素选择3 个水平，以沸水浴后混合液中的活菌数为指标，确定最佳组合，试验因素及水平安排见表1。

表1 最佳抗热保护剂优化正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of protectants in the orthogonal experiment

1.4.2.2 喷雾干燥条件的确定1）离心条件的确定

根据实验室前期研究，选定发酵液的离心条件为3 000 g，离心20 min。

2）单因素试验

①喷雾干燥机进口温度对直投式发酵剂的影响

将喷雾干燥机进口温度分别控制在100、110、120、130、140、150 ℃，进样流速控制为60 mL/h，离心后菌体与保护剂的配比控制为1 ∶10 进行喷雾干燥，测定发酵剂的活菌数。

②喷雾干燥机进样流速对直投式发酵剂的影响

将喷雾干燥机进口温度控制在120 ℃，进样流速为50、55、60、65、70 mL/h，离心后菌体与保护剂的配比控制为1 ∶10 进行喷雾干燥，测定发酵剂的活菌数。

③菌体与保护剂配比对直投式发酵剂的影响

将喷雾干燥机进口温度控制在120 ℃，进样流速为55 mL/h，离心后菌体与保护剂配比分别为：1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），进行喷雾干燥，测定发酵剂的活菌数。

1.4.2.3 喷雾干燥条件的响应面分析

根据单因素试验结果，应用CCD 中心组合试验设计原理，进一步分析喷雾干燥中进口温度、进样流速、离心后菌体与保护剂配比这3 个因素对直投式发酵剂活菌数的影响，以直投式发酵剂的活菌数为响应值，进行3 因素3 水平的响应面分析试验，确定喷雾干燥的最佳条件，试验因素及水平安排见表2。

表2 响应面分析因素及水平表Table 2 Factors and levels of response surface method（RSM）

1.4.3 嗜酸乳杆菌直投式发酵剂发酵活力的测定

采用真空方式对嗜酸乳杆菌直投式发酵剂进行封存，并将其储存于4 ℃冰箱，定期测定其活菌数。

2 结果与讨论

2.1 抗热保护剂的确定

2.1.1 单因素试验

嗜酸乳杆菌抗热能力较差，因此要选择合适的保护剂在喷雾干燥过程中对其进行保护。本试验选择保护剂分别为谷氨酸钠、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、β-糊精、多孔糊精、海藻酸钠、明胶。利用水浴模拟试验，确定其抗热能力。其结果如表3 所示。

表3 不同保护剂对嗜酸乳杆菌的保护作用Table 3 Different protectants on protection of Lactobacillus acidophilus

由表3可知，蔗糖和糊精对嗜酸乳杆菌的保护效果最明显。糖类物质具有替代水分子以及形成玻璃态的能力，在干燥过程中保护细胞膜维持蛋白质结构的稳定，从而起到很好的作用，同时对蛋白质、脂质体等生物系统的喷雾干燥有抑制损伤的作用[7]。因此选择蔗糖、糊精和脱脂奶粉进行进一步的优化，以确定最优组合。

2.1.2 抗热保护剂的正交优化试验

正交试验设计L9（33）优化单因素试验结果中抗热效果较好的蔗糖和糊精，以及脱脂奶粉的添加量因素，正交结果见表4。

表4 最佳抗热保护剂优化正交试验结果Table 4 Results and analysis of orthogonal for protectants experiment

由表4可知，3个因素中，对嗜酸乳杆菌的影响顺序为：C（脱脂奶粉）＞B（糊精）＞A（蔗糖），最佳增菌培养基配方为A2B3C2，即8%蔗糖，10%糊精，30%脱脂奶粉。由于此保护剂与高密度发酵液按1 ∶1 混合，则喷雾干燥用时的保护剂的配比为4%蔗糖，5%糊精，15%脱脂奶粉。

2.2 喷雾干燥条件的确定

2.2.1 喷雾干燥机进口温度对发酵剂的影响

将喷雾干燥机进口温度分别控制在100、110、120、130、140、150 ℃，进样流速控制为60 mL/h，离心后菌体与保护剂的配比控制为1 ∶10 进行喷雾干燥，测定发酵剂的活菌数。

表5 进口温度对发酵剂的影响Table 5 Effect of inlet air temperature on spray-drying starter

由表5可知，发酵剂的活菌数随着进口温度的升高，是一个先增加而后降低的趋势。原因是：进口温度过低时，干燥程度过低，导致发酵剂含水量过高，使发酵剂过多的黏附在喷雾干燥机中，且含水量也导致发酵剂活菌数的降低。进口温度过高，单位时间内提供的热量就越多，由于嗜酸乳杆菌抗热能力较差，虽然水分蒸发会带走大量的热量，抗热保护剂会对嗜酸乳杆菌起一定的保护作用，但过多的热量还是会导致嗜酸乳杆菌在喷雾干燥过程中大量死亡。所以本试验中合适的进口温度在120 ℃左右。

2.2.2 喷雾干燥机进样流速对发酵剂的影响

将喷雾干燥机进口温度控制在120 ℃，进样流速控制为50、55、60、65、70 mL/h，离心后菌体与保护剂的配比控制为1 ∶10 进行喷雾干燥，测定发酵剂的活菌数。

表6 进样流速对发酵剂的影响Table 6 Effect of material flow rate on spray-drying starter

由表6 可知，随着进样流速的增加，发酵剂的活菌数是一个增加后降低的趋势。原因是：当进样流速过低时，嗜酸乳杆菌在喷雾塔中停留时间就会过长，单位样品承受的热量过大，使嗜酸乳杆菌大量死亡。而进样流速过高，会导致单位时间内发酵剂水分蒸发量减少，使发酵剂过多的黏附在喷雾干燥机中，且含水量也导致发酵剂活菌数的降低。本试验中合适的进样流速为55 mL/h 左右。

2.2.3 菌体与保护剂配比对发酵剂的影响

将喷雾干燥机进口温度控制在120 ℃，进样流速控制为55mL/h，离心后菌体与保护剂配比分别为：1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），进行喷雾干燥，测定发酵剂的活菌数见表7。

表7 菌体与保护剂配比对发酵剂的影响Table 7 Effect of different content of bacteria and protectants on spray-drying starter

抗热保护剂的添加能在嗜酸乳杆菌表面形成保护层，减少菌体暴露于空气介质中的面积，减少由于细胞壁损坏而引起胞内物质的泄漏，从而起到保护作用。由表7 可知，随着抗热保护剂添加量的增加，发酵剂的活菌数是一个先增加后降低的趋势。当抗热保护剂的添加量过低时，其对菌体的包裹程度不够，使菌体过多的暴露在高温下，导致菌体大量死亡。当抗热保护剂添加量过高时，单位样品中菌体数会相对减少，同时样品溶液过于黏稠，也不利于喷雾干燥。本试验中的菌体与保护剂的合适配比为1 ∶30 左右。

2.3 喷雾干燥条件的响应面分析

2.3.1 发酵剂活菌数二次模型方程的建立与检验

根据单因素试验结果，应用CCD 中心组合试验设计原理，对喷雾干燥的进口温度、进样流速、离心后菌体与保护剂配比这3 个因素，进行3 因素3 水平响应面分析，结果见表8。

通过Design Expert 软件对表中试验数据进行二次多项回归拟合，发酵剂活菌数对进口温度、进样流速以及菌体与保护剂配比的二次多项式回归方程为：

表8 响应面试验结果Table 8 Results of RSM experiments

Y=13.02-0.29A-0.25B-0.63C-0.40AB+0.075AC+0.100BC-1.86A2-1.79B2-1.58C2

式中：Y 为预测相应值，A、B、C 分别为进口温度、进样流速以及菌体与保护剂配比的编码值。该二次回归方程方差分析结果见下表9。

表9 CCD 试验方差分析Table 9 Variance analysis of CCD experiment

2.3.2 发酵剂活菌数的响应面交互作用与优化

2.3.2.1 进口温度与进样流速的交互影响

图1 显示了进口温度和进样流速对嗜酸乳杆菌发酵剂活菌数的交互影响，在进样流速不变的条件下，随着进口温度的增加，嗜酸乳杆菌发酵剂的活菌数先上升后下降的趋势变化比较显著，这是由于温度逐渐升高，干燥效果较好，发酵剂的活菌数较高；但温度继续升高，嗜酸乳杆菌逐渐失活，造成发酵剂活菌数下降。在进口温度不变的条件下，随着进样流速的增加，嗜酸乳杆菌发酵剂的活菌数也出现了先上升后下降的趋势。

图1 （a，b）进口温度和进样流速对发酵剂活菌数影响的响应面图和等高线图Fig.1 （a，b）Contour and response surface plots showing the interactive effects of inlet air temperature and material flow rate on spray-drying starter

2.3.2.2 进口温度和菌体与保护剂配比的交互影响

图2 显示了进口温度和菌体与保护剂配比对嗜酸乳杆菌发酵剂活菌数的交互影响。在进口温度不变的条件下，随着保护剂添加量的增大，发酵剂活菌数出现先上升后下降的趋势明显，这是由于保护剂的添加能在嗜酸乳杆菌表面形成保护层，减少菌体暴露于空气介质中的面积，减少由于细胞壁损坏而引起胞内物质的泄漏，从而起到保护作用，但是随着保护剂添加量的不断增大，单位样品中菌体数会相对减少，而且样品黏稠度增大，损失在喷雾干燥机中的也越多。在菌体与保护剂配比不变的条件下，随着进口温度的不断增加，发酵剂活菌数也出现先上升后下降的明显趋势。

图2 （a，b）进口温度和菌体与保护剂配比对发酵剂活菌数影响的响应面图和等高线图Fig.2 （a，b）Contour and response surface plots showing the interactive effects of inlet air temperature and different content of bacteria and protectants on spray-drying starter

2.3.2.3 进样流速和菌体与保护剂配比的交互影响

图3 显示了进样流速和菌体与保护剂配比对嗜酸乳杆菌发酵剂活菌数的交互影响。

在菌体与保护剂配比不变的条件下，随着进样流速的增大，发酵剂活菌数的变化是先增大后减小的趋势。这可能是由于当进样流速过低时，嗜酸乳杆菌在喷雾塔中停留时间就会过长，单位样品承受的热量过大，使嗜酸乳杆菌大量死亡。而进样流速过高，会导致单位时间内发酵剂水分蒸发量减少，使发酵剂过多的黏附在喷雾干燥机中，且含水量也导致发酵剂活菌数的降低。当进样流速不变的条件下，随着保护剂添加量的增加，发酵剂活菌数先增大后减小的趋势明显。

图3 （a，b）进样流速和菌体与保护剂配比对发酵剂活菌数影响的响应面图和等高线图Fig.3 （a，b）Contour and response surface plots showing the interactive effects of material flow rate and different content of bacteria and protectants on spray-drying starter

经CCD 响应面设计优化后嗜酸乳杆菌发酵剂喷雾干燥的最佳条件为：进口温度119.23℃，进样流速54.66 mL/h，菌体与保护剂配比1 ∶27.95。最大值为13.1×108cfu/g。

根据工业化生产中喷雾干燥塔的实际操作要求，将喷雾干燥的最佳条件定为：进口温度119 ℃，进样流速55 mL/h，菌体与保护剂配比1 ∶28。

2.4 验证试验

按照预测的最佳喷雾条件做重复试验，三次试验得到嗜酸乳杆菌发酵剂的活菌数为1.67×109cfu/g，说明该模型能较好的反映实际情况。

2.5 嗜酸乳杆菌直投式发酵剂扫描电镜结果

利用扫描电镜观察了嗜酸乳杆菌直投式发酵剂以及改良MRS 培养基中的菌体和直投式发酵剂复水后的菌体的变化，如图4。

图4 嗜酸乳杆菌直投式发酵剂扫描电镜图（×3K）Fig.4 Scanning electron micrographs of DVS of Lactobacillus acidophilus（×3K）

图4 显示了嗜酸乳杆菌直投式发酵剂的表征，干燥后的发酵剂主要呈不规则球形，少数菌体会很小的一部分暴露出保护剂面，大部分菌体被包裹在保护剂之中，在保护剂之外没有观察到完整的菌体，表明只有被保护剂包裹的菌体才可以在高温干燥后存活下来，这也说明需要添加足够量保护剂，才能包裹尽量多的菌体。

2.6 嗜酸乳杆菌直投式发酵剂储存稳定性的测定

表10 显示的是嗜酸乳杆菌直投式发酵剂在4 ℃真空包装储存半年的活菌数变化。

表10 嗜酸乳杆菌直投式发酵剂储存稳定性的测定Table 10 The storage experiment of Lactobacillus acidophilus spray-drying starter

由表10 可知，喷雾干燥技术制备的嗜酸乳杆菌直投式发酵剂具有较高的活菌数，储存1 个月后仍具有较高菌活，活菌数为1.32×109cfu/g，储存半年后活菌数仍可达到9.2×108cfu/g，仍可达到106cfu/g，表明4 ℃真空包装储存方式良好。

3 结论

通过单因素和正交试验，确定了抗热保护剂的最佳配比为：4%蔗糖，5%糊精，15%脱脂奶粉。通过单因素和响应面分析法，确定了喷雾干燥技术制备嗜酸乳杆菌直投式发酵剂的最佳工艺参数：进口温度119 ℃，进样流速55 mL/h，菌体与保护剂配比1 ∶28。制备出的嗜酸乳杆菌直投式发酵剂的活菌数为1.67×109cfu/g。

[1] 张书猛．喷雾干燥制备益生菌发酵剂的研究[D]．西安:陕西科技大学,2012

[2] 曲微,范俊华,霍贵成．益生菌喷雾干燥技术的研究进展[J]．乳品加工,2008(4):36－38

[3] 毛健,宁佳,赵建新,等．不同酸奶发酵剂菌株发酵性质的评价[J]．中国乳品工业,2010,38(12):8－11

[4] 张兰威,鄂志强,万海峰,等．乳酸菌增菌培养基的筛选及干燥保护剂的选择[J]．中国乳品工业,2000,28(2):7－9

[5] 孙灵霞,张秋会,李红,等．直投式酸奶发酵剂在酸奶制作中应用的初步研究[J]．食品与发酵科技,2011,47(6):63－69

[6] 于章龙,武慧媛,李永歌,等．喷雾干燥与水浴模拟实验条件[J]．食品工业科技,2011,32(2):101－103

[7] SB Leslie,E Israeli,B Lighthart,et al．Trehalose and sucrose protect both membrance and proteins in intact bacteria during drying[J]．Applied Environment and Microbiology,1995,61(3):3592－3597