快速提取蕤核叶黄酮类化合物

李雪姣，韩蕾，杨瑞林，朱广龙，魏学智，*

（1.山西师范大学生命科学学院，山西临汾041000；2.山西师范大学分析测试中心，山西临汾041000；3.华中农业大学植物科学技术学院，湖北武汉430070）

蕤核（Prinsepia uniflora Batal.），蔷薇科（Rosaceae）扁核木属（Prinsepia）的一种多年生落叶灌木，主要分布于山西、河南、内蒙古、陕西、甘肃等地，生长于向阳山坡或者干旱沙丘上，喜光、湿润，耐旱、耐寒，对环境适应能力较强[1]。蕤核具有很强的抗旱抗逆抗风沙性[2]，对于水土保持有很好的效果，开花期、结果期具有观赏价值。据《本草纲目》《本草经》等多部典籍记载，根、叶、种子都具有药用价值，对于药用机理目前研究较少，主要在蕤核果实营养成分分析[3]、扁核木叶片黄酮提取工艺[4]、引种栽培[5]、蕤核叶片解剖结构和组织化学定位研究[6]等方面有研究。黄酮类化合物是近年来研究的热点之一，具有很强的抗氧化性，有效清除体内的氧自由基，阻止细胞的退化、衰老，也可抑制癌症的发生，改善血液循环，降低胆固醇和血糖，提高免疫力，主要的研究有黄酮类化合物的提取、分离纯化的方法[7]，以及作用机理[8]。但对蕤核叶黄酮类化合物的研究尚在起步阶段，具有广阔的应用前景和研究价值。

快速溶剂萃取法是一种较新的提取方法，与通常的超声提取、索氏提取、微波萃取技术等方法相比，具有速度快，效率高，用量少，重复性好[9]等优点。ASE300快速溶剂萃取仪的工作原理是利用高温高压来提高萃取率，使用常规的溶剂对固体或半固体样品进行萃取，可以进行痕量有机物的处理[10]，应用领域广泛，如海面溢油[11]，农药残留[12]，土壤成分分析[13]，刑事技术[14]等。

1 材料试剂与仪器

1.1 实验材料与试剂

蕤核叶片：采集于山西省临汾市城西龙祠村。芦丁标品：国药集团化学试剂有限公司；纯水：自制；C2H5OH、NaNO2、NaOH、Al（NO3）3，所有试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

ASE300 型快速溶剂萃取仪：戴安公司；WFJ-7200型可见光分光光度计：上海龙尼柯仪器有限公司；FA1004A 型电子天平：上海维菱科学仪器有限公司；101-3BS 型电热鼓风干燥箱：金坛市荣华仪器制造有限公司；DELI-500A 型中药粉碎机：广州大祥电子机械设备有限公司。

2 方法

2.1 材料预处理

于10月份选取长势较茂盛的植株，将其叶片进行采摘，洗净晾干，放置在烘箱中50 ℃～60 ℃烘干，粉碎过筛（60 M）后置于冰箱中保存备用。

2.2 标准曲线的制作与绘制

参照梁晓华，徐成东，王陆琴[15]总黄酮的测定方法。

称取芦丁标准液5.0 mg，用浓度60%微热乙醇溶液定容至50 mL，摇匀得浓度为0.1 mg/mL 的标准液。准确吸取标准应用液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于6 只比色管中，加浓度30%乙醇至5 mL，加浓度5%NaNO2溶液0.3 mL 摇匀，放置6 min，加浓度10 %Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀放置6 min，加浓度1 mol/L NaOH 溶液4 mL，加水0.4 mL，摇匀静置15 min，以试剂作为空白参比液，于510 nm 波长处测定吸光度A。以吸光度值A 为纵坐标，浓度C（mg/mL）为横坐标进行线性回归，求取线性方程。

得出线性回归方程：A=0.011 3C+0.000 5 （R2=0.999 8）

2.3 蕤核叶黄酮类化合物的提取与测定

本实验以乙醇-水为提取溶剂，选用ASE300 来提取蕤核叶黄酮类化合物。准确称取预处理的蕤核叶粉末，置于萃取池安放到位，收集瓶、废液瓶置于托盘上。溶剂瓶中注入无水乙醇、纯水（预先脱气）。建立ASE300 提取的方法表、计划表，装载运行。

样品含量测定：准确吸取提取液0.2 mL 置于干净的试管中，加浓度30%的乙醇至5 mL，按标准曲线的制备方法测定吸光度A。

2.4 单因素试验

本试验确定样品质量为1 g，乙醇作为溶剂，萃取池规格34 mL，在系统压力1 500 psi，氮气吹扫90 s 的条件下对炉体加热温度、溶剂浓度、静态萃取时间、提取循环次数4 个单因素进行考察。

2.5 正交设计

黄酮类化合物的提取过程受多个因素影响，为了得到较科学的提取工艺条件，将溶剂浓度、炉体加热温度、静态萃取时间及循环次数四个单因素作为考察对象，设计四因素三水平L9（34）的正交试验，优化提取工艺。

3 结果与分析

3.1 乙醇浓度对提取蕤核叶黄酮类化合物的影响

设定乙醇浓度40%、50%、60%、70 %、80 %，炉体加热温度80 ℃，静态萃取5 min，萃取循环1 次。测定吸光值并计算得率，研究不同乙醇溶液体积分数对黄酮提取率的影响，结果见图1。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids

从图1 曲线可以看出，当乙醇浓度在40%～60%之间随着浓度的升高提取率逐渐上升，当溶剂的浓度为60%时提取率最高，当浓度大于60%时提取率反而随着溶剂浓度的升高逐渐降低，黄酮类化合物不是单纯的脂溶性有机物，有一定的亲水性，单纯有机溶剂或水溶液提取的效率都很低。本试验选择乙醇和水按比例混合后作为，因此提取蕤核叶黄酮的溶剂浓度选取50%、60%、70%3 个水平。

3.2 炉体加热温度对提取蕤核叶黄酮类化合物的影响

设定炉体加热温度70、80、90、100、110、120 ℃，溶剂为60%乙醇，静态萃取5 min，循环1 次。测定吸光值并计算得率，研究不同炉体加热温度对黄酮提取率的影响，结果见图2。

图2 炉体加热温度对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of fumace heating temperature on yield of flavonoids

从图2 曲线走势可以看出，炉体加热温度对提取蕤核叶片的影响趋势，100 ℃时黄酮得率最高，在温度低于100 ℃的阶段提取率基本呈上升趋势，超过100 ℃以后黄酮得率反而下降。温度过高可能会破坏黄酮类化合物的结构而降低提取率。所以炉体加热温度选取90、100、110 ℃3 个水平。

3.3 静态萃取时间对提取蕤核叶黄酮类化合物的影响

设定静态萃取时间3、5、7、9、11 min，溶剂为60%乙醇，炉体加热温度100 ℃，萃取循环1 次。测定吸光值并计算得率，研究不同静态萃取时间对黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3 静态萃取时间对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of static extration time on yield of flavonoids

图3 趋势线显示，静态萃取的时间对提取率的影响整体呈现上升趋势，时间达到9 min 时提取率最高，随着时间的延长提取率未呈现明显升高趋势，考虑到节省原料及实验周期。所以静态萃取时间选择7、9、11 min 3 个水平。

3.4 循环次数对提取蕤核叶黄酮类化合物的影响

设定萃取循环次数1、2、3、4、5 次，溶剂为60%乙醇，炉体加热温度100 ℃，静态萃取9 min。测定吸光值并计算得率，研究不同循环次数对黄酮提取率的影响，结果见图4。

图4 循环次数对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of the number of cycles on yield of flavonoids

从图4 的曲线可以看出，提取的循环次数为1 次和2 次时提取率都比较低，当循环3 次时比较高，之后的4、5 次提取率几乎不上升。将蕤核叶片循环提取3次后，提取率达到5.4%，叶片几乎为白色，增加循环次数提取率几乎不变，所以循环萃取3 次为最佳状态，更利于节约实验材料和能源。所以快速提取蕤核叶片中黄酮时选择循环次数为2、3、4 次。

3.6 正交分析

采用L9（34）正交设计表对单因素结果进行安排实验，优化提取的工艺条件。因素水平表见表1，结果见表2。

表1 因素水平表L9（34）Table 1 The factor levels of orthogonal test

表2 正交试验结果L9（34）Table 2 The results of orthogonal test

续表2 正交试验结果L9（34）Continue table 2 The results of orthogonal test

从表2 结果可以看出，通过均值直观分析，得出ASE300 快速萃取蕤核叶片黄酮类化合物的因素水平组合为：A2B3C1D2。极差分析得出，4 个因素对提取率的影响，炉体加热温度和乙醇浓度对提取的影响较为明显，静态萃取时间和循环次数的影响相对较小，即B＞A＞C＞D。

4 结论

使用ASE300 快速溶剂萃取仪提取蕤核叶片中的黄酮类化合物，经过单因素试验及正交设计的优化，得到最佳的提取工艺条件：萃取溶剂为60%乙醇，炉体加热温度110 ℃，静态萃取7 min，循环提取3 次，得出提取率为8.98%。炉体加热温度对提取率的影响最大，其次是乙醇浓度，静态萃取时间和提取循环次数相对较小。

[1] 陆玲娣．中国植物志[M]．北京:科学出版社,1986

[2] 杨福红,赵晓明,赵海燕,等. 蕤核的研究进展[J]. 山西农业科学,2008,36(9):94-96

[3] 斯琴,敖特根． 蕤核果实营养成分分析[J]． 内蒙古草业,2007,19(1):55-56

[4] 张秀秀,魏学智．响应面法优化扁核木叶片总黄酮提取工艺[J]．中国野生植物资源,2011,30(2):27-31

[5] 付强,孙晓梅,李雪飞．东北扁核木育苗方法[J]．辽宁林业科技,2001(6):35-39

[6] 陈婧,杨瑞林,朱广龙,等.蕤核叶片解剖结构和组织化学定位研究[J].植物研究,2012,32(3):275-278

[7] 严振宇,张秋菊.黄酮类化合物提取分离方法简介[J].微量元素与健康研究,2012,29(3):55-57,70

[8] 佟永薇. 黄酮类化合物提取方法的研究及展望[J].食品研究与开发,2008,29(7):188-190

[9] 刘静.戴安公司ASE 快速溶剂萃取技术—解决您化学实验样品前处理的最新技术[J].检验检疫科学,2003,13(2):58

[10] 高蓓蕾.固体或半固体中痕量有机污染物分析的前处理方法[J].污染防治技术,2004,17(1):32-33

[11] 王丽,卓林,何鹰,等.近红外光谱技术鉴别海面溢油[J].光谱学与光谱分析,2004,24(12):1537-1539

[12] 李俊,王震,庞宏宇,等.薏苡仁中多种农药残留的测定[J].食品科学,2012,33(4):148-152

[13] CLERES S,GRUBER L,LASTENNET G,等.用快速溶剂萃取仪测定土壤中的二噁英和呋喃[R].环境科技,2010,23(5):61-63

[14] 张建华,陈宁.快速溶剂萃取法及其在刑事技术中的应用[J].政法学刊,2003,20(5):68-69

[15] 梁晓华,徐成东,王陆琴.云南13 种蕨类植物中总黄酮的测定[J].安徽农业科学,2008,36(19):7965-7966