蜂胶中黄酮类化合物清除自由基性能研究

郭志芳，马川兰，贾娟

（漯河职业技术学院食品工程系，河南漯河462000）

蜂胶（propolis）是工蜂采集杨属（Populus）等植物的树皮、幼芽、花蕾等的分泌物中的黏性树脂成分，与自己的唾液即上腭腺分泌物、蜂蜡等相混调合而成的一种天然物质，具有抗氧化、抗肿瘤等作用[1-3]。自由基是指具有未配对价电子的原子、原子团、分子和离子，过量的自由基可危害人体健康。实验证明，蜂胶提取物有较好的清除羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（·O2-）的能力，其中所含的黄酮类化合物和萜烯类化合物均具有清除自由基的作用[4-5]。

从文献检索发现目前国内用化学发光法对蜂胶清除自由基的研究比较少，且大多未排除萜烯类化合物的干扰，因此，采用化学发光法对蜂胶提取物清除超氧阴离子和羟自由基的能力进行测定，将黄酮类化合物含量较高的提取物清除自由基的能力与萜烯类化合物含量较高的提取物及两种黄酮单体清除自由基的能力进行比较，探讨蜂胶中黄酮类化合物清除自由基的能力。

1 实验材料、药品与仪器

1.1 材料

毛蜂胶，由汪氏蜂业集团有限公司提供；槲皮素（sigma 公司）、芦丁（sigma 公司），均为分析纯试剂。

1.2 药品

无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、纯度99.5%以上的CO2、硅胶、CuSO4、VC、H2O2、邻菲啰啉、邻苯三酚、鲁米诺（sigma 公司）、HCl、NaOH 等，均为分析纯试剂。

1.3 仪器

HA121-50-01 超临界CO2萃取装置：江苏南通华安超临界萃取有限公司；R502B2 旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；SHZ-III 型循环真空泵：上海亚荣生化仪器厂；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；BPCL 微弱发光测量仪：中国科学院生物物理研究所；电子分析天平、pH 计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；气相色谱-质谱联用仪（GC-MS Agilent-6890N/5973i）：安捷伦科技有限公司。

2 实验方法

2.1 实验样品的制备

2.1.1 蜂胶乙醇提取样品

蜂胶原料→脱蜡→冷冻→粉碎→称重→70%乙醇提取→过滤→浓缩→蜂胶浸膏→记为样品1。

2.1.2 蜂胶挥发油样品

蜂胶原料→脱蜡→冷冻、粉碎、制粒、投料→超临界CO2萃取→超临界CO2萃取物→乙酸乙酯萃取→浓缩→冷冻过滤→浓缩→石油醚反萃取→浓缩→挥发油样品→记为样品2。

2.1.3 黄酮单体

芦丁→记为样品3；槲皮素→记为样品4。

2.2 实验样品GC-MS 分析

色谱条件：HP-5 弹性石英毛细管柱，FID 检测器，载气为高纯He（99.999%），流量为1.0 mL/min，进样量为1 μL，采用程序升温。

质谱条件：离子源为EI；质量扫描范围：m/z50 amu～550 amu。色谱工作站为HP-5，数据库为nist2002。

2.3 样品清除自由基实验

2.3.1 待测试样溶液的制备

1）取样品1、样品3、样品4 用无水乙醇配制溶液，浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；

2）取样品2 用无水乙醇与乙酸乙酯混合溶剂（比例为1 ∶1）配制溶液，浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL。

2.3.2 羟自由基的清除实验[6]

在发光杯中依次加入2 mmol/L 的新鲜VC溶液200 μL，2 mmol/L 的CuSO4溶液400 μL，2 mmol/L 的邻菲啰啉溶液400 μL，加0.1 mol/L pH8.0 的磷酸缓冲液600 μL，再加50 μL 待测试样溶液，混匀，放入发光仪的反应池内，用600 μL 的100 mmol/L H2O2溶液启动发光，测定250 s 内发光强度。空白对照以试样溶剂代替试样溶液。

2.3.3 超氧阴离子自由基的清除实验[7]

在发光杯中依次加入待测试样溶液20 μL，1 mmol/L的邻苯三酚溶液10 μL，放入发光仪的反应池内，原位注入970 μL 鲁米诺（1 mmol/L）—碳酸缓冲液（pH 10.2），启动发光，测定250 s 内发光强度。空白对照以试样溶剂代替试样溶液。

2.3.4 发光抑制率的计算

发光抑制率=（空白发光曲线总面积-样品发光曲线总面积）/空白发光曲线总面积×100%

3 结果与讨论

3.1 GC-MS 分析结果

将GC/MS 分析结果按类别分类，得提取样品的化学组成，见表1。

表1 提取样品的化学组成Table 1 The chemical composition of the extractions %

从蜂胶样品的化学组成可知：样品1 中，黄酮类化合物总相对含量为40.04 %，其中柯因含量高达12.25%，松属素含量达到9.90%，2，6-二羟基-4-甲氧基查耳酮含量达到4.71%，高良姜素含量达到4.40%，而萜烯类化合物总相对含量仅为11.04%；样品2 中，萜烯类化合物总相对含量为12.98%，而黄酮类化合物为2’，6’-二羟基-4-甲氧基查尔酮和柚木柯因两种，其含量仅为2.32%。

3.2 清除自由基实验的结果讨论

3.2.1 清除羟自由基

以样品浓度为横坐标，对羟自由基的抑制率为纵坐标，做各样品的抑制率曲线见图1。

图1 样品对羟自由基抑制率曲线Fig.1 The hydroxyl radical inhibition rate curve of the samples

从图1 中可以看出，样品1 与样品4 清除羟自由基的能力相当，样品3 较弱，样品2 最弱。同时，增大样品浓度，对羟自由基的抑制率均有很大提高。从图1中可以直接读出发光抑制率为50%时，样品1 的浓度IC50≈0.25 mg/mL，样品2 的浓度IC50≈1.272 mg/mL，样品3 的浓度IC50≈0.327 mg/mL，样品4 的浓度IC50≈0.27 mg/mL。实验结果表明蜂胶乙醇提取物清除羟自由基的能力很强，且与黄酮单体槲皮素相当，略强于芦丁，明显强于挥发油样品。

3.2.2 清除超氧阴离子自由基

以样品浓度为横坐标，对超氧阴离子自由基的抑制率为纵坐标，做各样品的抑制率曲线见图2。

图2 样品对超氧阴离子自由基抑制率曲线Fig.2 The superoxide anion radical inhibition rate curve of the samples

从图2 中可以看出，样品4 清除超氧阴离子自由基的能力最强，样品1 次之，样品3 较弱，样品2 最弱。同时，增大样品浓度，对超氧阴离子自由基的抑制率均有很大提高。从图2 中还可以直接读出发光抑制率为50%时，样品1 的浓度IC50≈0.085 mg/mL，样品2 的浓度IC50≈0.748mg/mL，样品3 的浓度IC50≈0.195mg/mL，样品4 的浓度IC50≈0.022 mg/mL。实验结果表明蜂胶乙醇提取物清除超氧阴离子自由基的能力强于芦丁和挥发油样品，但比黄酮单体槲皮素稍差。

蜂胶中的黄酮类化合物和萜烯类化合物均对自由基有一定的清除作用，结合成分分析结果，黄酮类化合物含量较高的样品1 清除自由基能力较强，而萜烯类化合物含量较高的样品2 清除自由基的能力较弱，这说明蜂胶中的黄酮类化合物在乙醇提取物清除自由基的过程中起主要作用。

3 结论

蜂胶乙醇提取样品、蜂胶挥发油样品、芦丁、槲皮素对羟自由基的发光抑制率IC50分别为0.25、1.272、0.327、0.27 mg/mL；对超氧阴离子自由基的发光抑制率IC50分别为0.085、0.748、0.195、0.022 mg/mL。GC/MS 分析结果表明，蜂胶乙醇提取样品中的黄酮类化合物总相对含量为40.04 %，萜烯类化合物总相对含量为11.04%；蜂胶挥发油样品中黄酮类化合物总相对含量为2.32%，萜烯类化合物总相对含量为12.98%。

结果表明，黄酮类化合物含量较高的蜂胶乙醇提取物清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力均强于芦丁，且明显强于萜烯类化合物含量较高的蜂胶挥发油样品，同时，其清除羟自由基的能力与黄酮单体槲皮素相当，清除超氧阴离子自由基的能力比槲皮素稍差。综上所述，蜂胶中黄酮类化合物具有很好的清除自由基的能力。

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