银合欢叶黄酮的提取工艺

姜建辉，赵俭波，王贵云

（塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

银合欢为豆科（Leguminosae）含羞草亚科（Mimosoideae）银合欢属（Leucaena Bentham）多年生灌木或乔木，原产美洲，现广泛分布于世界热带亚热带地区[1]，目前，我国栽培利用的主要品种是银合欢[L.leucocephala（Lamarck）de Wit]，该品种适应性强、速生高产、营养价值高、适口性好、易于栽培。合欢叶有安神解郁、活血消肿、用于心神不安、忧郁失眠、痈疮肿毒、筋骨折伤，还具有吸收空气中硫氧化物的作用，因而它能够净化空气、美化环境，是调节人们精神生活的优良树种[2]。银合欢叶含有黄酮、生物碱、挥发油等多种化学成分[3]。李学坚等进行了银合欢叶提取物对实验动物的降血糖效果的研究，可望使银合欢叶成为开发降血糖药物的资源[4]。近年来，银合欢叶资源化利用研究渐成热点[4-6]，但鲜见测定银合欢叶黄酮含量的报道。

黄酮类化合物广泛存在于自然界植物中，大部分具有较强的抗氧化活性，能起到广谱抑菌、消炎和抗毒素的作用[7]。植物中黄酮化合物以其纯天然、高活性、见效快等特点得到国内外科研人员的极大关注，目前已开发了多种药用植物黄酮产品。因此，研究从银合欢叶中提取黄酮类化合物对银合欢的开发利用具有重要意义。论文对银合欢叶的黄酮提取工艺进行了探索和优化，从溶剂的浓度、提取时间、提取温度和料液比的单因素实验，以及正交实验进行考察研究，找到银合欢叶黄酮提取的最优工艺，为银合欢叶黄酮的工业化生产提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DF-101S 集热磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；电子天平：上海菁海仪器有限公司；SENCORW2-180SP：上海申生科技有限公司；722N 可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；KQ3200DE 型数控超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；KQ-C 玻璃仪器气流烘干器：巩义市予华仪器有限责任公司；SK1517电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；标准检验筛：上虞市仪器设备厂。

银合欢叶样品于2012年10月中旬采自新疆阿拉尔塔里木大学校园，银合欢叶采集后清洗干净、晾干、粉碎并过40 目筛，收集备用。芦丁对照品（生物纯纯度≥95%，上海蓝季科技发展有限公司）；无水乙醇、硝酸铝、氯仿（均为分析纯）、亚硝酸钠（化学纯）、蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制备

1.2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取60 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20.0 mg，用30%的乙醇定容于100 mL 容量瓶中，制成浓度为0.2 mg/mL 的对照品溶液。

1.2.1.2 工艺流程

银合欢叶粉末→醇提（两次）→合并滤液→过滤→浓缩→少量水分散，氯仿萃取（除去叶绿素等脂溶性杂质）→过滤→浓缩→30%乙醇溶解→过滤并定容→测定。

1.2.1.3 样品溶液的制备

称取银合欢树叶粉末1.00 g，置于250 mL 圆底烧瓶中，按“1.2.1.1”方法在一定的乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比条件下进行提取，滤液过滤定容于25 mL 容量瓶中，即得。

1.2.2 测定波长的选择

精密量取“1.2.1.1”项下对照品溶液4.00 mL 于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加入5%NaNO20.7mL 摇匀，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，在400 nm～750 nm 处扫描，结果对照品溶液在508 nm 处具有最大吸收。

1.2.3 标准曲线的绘制[8]

精密量取“1.2.1.1”项下对照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加入5%NaNO20.7 mL，摇匀，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，再加30 %乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，在508 nm 处，测定吸收度值。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 样品溶液的测定

移取“1.2.1.3”项下样品溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，按“1.2.3”方法测定样品的吸光度，从工作曲线中查出黄酮浓度，由此计算出黄酮得率。

式中：C 为标准曲线上获得的浓度，（mg/mL）；V0为黄酮初提液定容后的体积，mL；V1为提取液测定时定容后的体积，mL；V2为提取液测定时的体积，mL；W为叶子干粉的质量，g。

图1 标准曲线图Table 1 Curve diagram

1.2.5 重复性试验

为验证选定的最佳提取工艺的重复性，分别称取6 份银合欢叶粉末1.00 g，以最佳提取工艺进行6 次平行试验，按“1.2.1.3”项下方法制备样品溶液，移取1.00 mL 于25 mL 容量瓶中，显色，测定。

1.3 单因素实验

称取银合欢树叶粉末1.00 g，精密称量，置于250 mL圆底烧瓶中，在不同条件下提取，考察不同提取时间、乙醇浓度、料液比和提取温度对银合欢叶中黄酮提取效果的影响。

1.4 正交实验

通过单因素试验对银合欢叶黄酮的提取条件进行初步研究，，发现各条件对银合欢叶黄酮的提取率均有一定的影响，选择L9（34）表安排正交试验，优化银合欢叶叶黄酮提取工艺。试验设计见表1。

表1 银合欢叶黄酮最佳提取条件正交试验设计Table 1 Leucaena leucocephala leaf total flavone extraction condition orthogonal test design

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取温度对黄酮提取率的影响

以60%乙醇为提取溶剂，在物料粒度40 目，超声功率150 W，料液比1 ∶20（g/mL），时间20 min，提取两次。以提取率为评价指标，考察温度的影响，结果见图2。

图2 提取温度对黄酮提取率的影响Fig.2 Impact of extraction temperature on extraction of flavones

温度越高，分子运动越剧烈，渗透、扩散、溶解速度越快。同时，高温可以引起细胞膜结构的变化，使黄酮类化合物更容易被萃取到溶剂中。因此，随着提取温度的升高，黄酮得率随之增加，在35 ℃时黄酮提取率最高。当温度超过35 ℃时，黄酮得率有所下降。可能是因为水溶性黄酮可能发生水解导致提取率下降，因此，提取温度选择35 ℃左右为宜。

2.1.2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

在物料粒度40 目，超声功率150 W，料液比1∶20（g/mL），温度35 ℃，时间20 min，提取两次。以提取率为评价指标，考察乙醇浓度的影响，结果见图3。

图3 乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction of flavones

由结果如图3 可知，随乙醇浓度的增加，黄酮提取率增大，当浓度达到60%时提取率最大，随着乙醇浓度继续增加，提取率则开始下降，这可能是乙醇浓度不同，极性也不同，60%乙醇的极性与银合欢叶的黄酮类化合物极性相近，当乙醇浓度超过60%时，一些脂溶性的物质溶出增加，影响了黄酮类物质的浸出，因此黄酮得率减少。故宜选用60%乙醇为提取溶剂。

2.1.3 料液比对黄酮提取率的影响

以60%乙醇为提取溶剂，在物料粒度40 目，超声功率150 W，温度35 ℃，时间20 min，提取两次。以提取率为评价指标，考察料液比的影响，结果见图4。

图4 料液比对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction of flavones

结果如图4 可知，在1 ∶25（g/mL）时提取率最大。随着溶剂量增加，黄酮的溶出量变大。当黄酮充分溶出后，即使继续加大溶剂量，黄酮的含量基本趋于稳定，而溶剂的及能源的成本相对较高。因此，本实验确定最佳料液比为1 ∶25（g/mL）。

2.1.4 提取时间对黄酮提取率的影响

以60%乙醇为提取溶剂，在物料粒度40 目，超声功率150 W，温度35 ℃，料液比1 ∶25（g/mL）提取两次。以提取率为评价指标，考察提取时间的影响，结果见图5。

图5 提取时间对黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction of flavones

结果如图5 可知，提取20 min 时得率最高，超过了20 min 后，黄酮得率反而下降，可能是超声时间过长，提取过程中杂质含量增加，致使有效成分下降[14]。故确定最佳提取时间为20 min。

2.2.1 银合欢叶叶黄酮最佳提取条件正交试验结果

鉴于乙醇浓度、提取时间、料液比、对银合欢叶黄酮的提取均有一定的影响，通过正交试验确定最佳提取条件，结果见表2。

表2 黄酮提取正交试验结果Table 2 The results of the orthogonal experiment

由表2 可知，各因素对银合欢叶黄酮提取率的影响程度由大到小依次为：乙醇浓度＞料液比＞提取温度＞提取时间，极差分析结果表明，A1B1C2D3组合的提取率最高。最终确定银合欢叶黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度为50%、料液比为1 ∶25（g/mL）、提取温度为35 ℃、提取时间为15 min。

2.2.2 最佳条件的验证试验

按照上述确定的最佳试验条件A1B1C2D3，重复进行3 次试验，黄酮提取率分别为2.072 % 、2.054 %、2.066%，平均为2.064%。

2.2.3 重复性试验

按选定的A1B1C2D3条件进行6 次平行试验，结果见表3。结果RSD 为1.04%（n=6），用此工艺提取银合欢叶中黄酮，重复性良好。

表3 重复性试验测定结果Table 3 Results in repeated test

3 结论

通过单因素试验和正交试验表明，影响黄酮提取率的因素主次顺序为乙醇浓度＞料液比＞提取温度＞提取时间，优化了银合欢叶中黄酮提取的工艺条件，初步筛选出提取黄酮的最佳工艺组合为A1B1C2D3。得出最佳提取工艺条件为：乙醇浓度50%，料液比1 ∶25，提取时间20 min，提取温度40 ℃，超声波辅助提取以其节省时间，易于控制等优点将逐渐代替传统提取方法。

[1] 黄维南,蔡克强.银合欢华南地区农林牧生产上有希望的速生树种[J].亚热带植物通报,1984(2):43-50

[2] 宋秀,王谦.合欢叶镇静催眠作用的药理研究[J].赤峰学院学报,2010,26(10):52-53

[3] 王恩举,梁德华,杨智蕴.银合欢叶黄酮类成分的研究[J].海南师范大学学报,2008,21(2):171-172

[4] 李学坚,邓家刚,覃振林.银合欢叶提取物降血糖作用的实验研究[J].天然产物研究与开发,2004,16(1):41-42

[5] 王恩举,梁德华,杨智蕴.银合欢叶黄酮类成分的研究[J].海南师范大学学报,2008,21(2):171-172

[6] 王强,王恩举,迪丽菲嘎尔等.银合欢叶成分槲皮素-3-O-鼠李糖甙的FT-IR 和FT-Raman 光谱[J].光散射学报,2000, 12(1):27-29

[7] 张鞍灵,刘国强,马琼等.黄酮类化合物生物活性与结构的关系[J].西北林学院学报,2001,16(2):75－79

[8] 王庆明,张金生,李丽华等.两种分光光度法测定党参中的黄酮[J].辽宁石油化工大学学报,2010,30(4):4－7