病毒类疫苗中外源病毒污染、检测方法与控制措施

范学政，李翠，宁宜宝，曲鸿飞

（中国兽医药品监察所，北京100081）

病毒类疫苗中外源病毒污染、检测方法与控制措施

范学政，李翠，宁宜宝*，曲鸿飞

（中国兽医药品监察所，北京100081）

就疫苗中污染外源病毒的情况、外源病毒传统检测技术及新型分子检测技术等进行了综述，并提出通过严格按照GMP规范组织生产，加强对菌（种）毒和细胞库的质量控制，严格控制生产检验原材料质量，进一步完善标准方法、提高检验水平，开展外源因子风险评估研究等措施以降低污染风险。

疫苗；外源病毒；检测方法；控制措施

疫苗是预防传染性疾病有效手段之一。在过去几十年里，由于传代细胞系和大规模培养技术的使用，疫苗生产技术已取得了令人瞩目的成就。然而，由于疫苗生产用原材料如动物组织、细胞基质、血清、胰蛋白酶等来源于动物，存在外源因子（extraneous agents，EA）污染的风险。外源因子是指生物制品生产过程中存在于菌毒种、细胞基质及生产制品所用的原材料及制品中的污染物，包括细菌、真菌、支原体和病毒，如源于牛血清的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是疫苗中最常见的污染物之一［1］。通常外源因子主要指病毒性外源因子（简称外源病毒），在过去60年中，发生过多起疫苗污染外源病毒事件。因部分外源病毒具有致病性，污染可能会引起生物安全问题。

目前经鉴定的病毒数量约2300种。然而，地球上的病毒种类可能超过150000种［2］。另外，病毒常以持续突变的方式进化，并产生许多突变株，形成病毒准种以快速适应环境［3］。因此，尚有大量病毒有待于发现和研究。但随着科学的发展，建立了许多新型检验技术，有些过去未发现的外源病毒逐渐引起人们的重视。本文就疫苗中污染外源病毒的历史与现状及外源病毒检验技术进行了综述，并提出了控制兽用疫苗质量的建议措施。

1 疫苗污染外源病毒情况回顾

20世纪50年代，用于疫苗生产的原代猴肾细胞培养基质发现了泡沫病毒（Spumaretroviridae）污染，引起细胞培养物中出现泡沫样融合，导致细胞裂解和细胞培养物破坏，但它不引起动物任何临床症状，被感染动物会终生持续带毒［4］。20世纪60年代，发现鸡胚成纤维细胞生产的黄热弱毒活苗污染了禽白血病毒（ALV）［5－6］；1990年在犬苗中发现可引起母狗流产和死胎的蓝舌病毒污染［7－9］；1996／1997年在丹麦使用的禽用活疫苗中发现了I型副粘病毒（APMV－1）污染［10］；2003年在CHO细胞传代过程中发现污染了杯状病毒（又名卡里西病毒，Calicivirus）［11］。

RD114是另一种新发现的EA，是一种复制型猫内源性γ－逆转录病毒，可感染猫科以外的宿主［12］，近几年在猫细小病毒疫苗［13］、犬细小病毒2型疫苗［14－15］等多种疫苗中被发现。RD114可来源于内源性逆转录病毒敏感细胞系，如CrFK细胞系［16］，该细胞系被广泛用于生产犬用疫苗。

目前为止最有名的人用疫苗污染事件当属20世纪小儿麻痹症疫苗中污染猿猴空泡病毒40（Simian vacuolating virus 40，SV40）事件。SV40是一种多瘤DNA病毒，有造成肿瘤发生的潜在能力，不过通常会维持于潜伏感染状态。由于用来培养疫苗病毒的猴肾细胞污染了SV40，导致疫苗污染。1955－1963年间，在美国、英国、澳大利亚、前苏联以及其他许多国家数千万人接受过小儿麻痹症疫苗注射，由于SV40存在潜在的致癌性，免疫后的癌症发生是否与此次疫苗污染事件有关，一直不明确，直到目前，也未发现污染疫苗与人肿瘤病例之间的联系［17］，尽管如此，此次事件还是引起了不小的恐慌和公众的高度关注。

近年来，发现婴儿广泛使用的轮状病毒疫苗Rotarix中有PCV1污染，引起了公众对疫苗生物安全的极大关注。葛兰素史克公司（GSK）确认在细胞库和种毒中存在PCV1，可能是生产过程中使用的猪胰酶带毒所致。PCV1对人体无害，对自然宿主猪也不致病，也没有任何一个国家出现Rotarix疫苗严重不良反应的报道。除了Rotarix疫苗外，在另一种抗轮状病毒疫苗Rotateq中发现污染了（Simian retrovirus，SRV）的DNA片断［18］。

我国生物制品生产用细胞也曾出现过外源因子污染［19］。20世纪80年代，普通鸡胚生产的禽用活疫苗中经常检出支原体污染［20］；禽用活疫苗中曾检出ALV、REV和CAV等外源病毒；猪瘟活疫苗（脾淋源）中检出兔出血症病毒（RHDV）［21］，而以前用原代牛睾丸细胞生产的猪瘟活疫苗（细胞源）污染BVDV比较严重［22］。

有些外源病毒的副作用和影响目前尚不能全面评估，如新型肝炎病毒（又名细环病毒，Torque teno virus，TTV），经PCR检测证实在含猪源原辅材料的生物制品（包括猪用疫苗）中普遍存在［23］，目前还未发现有害，还未作为控制的对象。然而，人为因素将病原引入新的宿主可能会带来十分复杂的病毒学情况，如用污染了圆环病毒的疫苗免疫猪时，对于断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的发生和扩散起到了重要作用［24］，而用羊脑生产的预防羊震颤病（Louping Ill）的灭活疫苗，与羊瘙痒病（Scrapie）蔓延有明确的关系［24］。因此，对于此类外源病毒还需长期关注。

2 外源病毒检测方法

2.1 传统检测方法 传统检测外源病毒的方法主要有血吸附检查法、细胞培养法、鸡胚检查法和实验动物抗体检测法。几十年来，传统的检测法已经成为广泛筛查外源病毒的标准方法。血凝抑制试验、免疫荧光等方法也可用来检测外源病毒。细胞培养在病毒检测中具有核心地位，大大方便了下游实验室分析。但是，许多潜在外源致病因子不能在细胞上复制，或者没有建立合适的动物模型，使得传统检测方法受到严重束缚。

2.2 常规PCR检测方法 核酸检测方法非常敏感，能检测到未出现发病症状时的少量病毒，但需要先知道待检测病毒的核酸序列［25］。此外，因为PCR等分子检验技术只检测核酸，不能证明是否感染，对于PCR阳性结果的解释较为复杂，经常需要进一步检测。如果PCR之前用RNase／DNase消化消除背景DNA，而病毒粒子的核酸会受到保护，不被降解，这种方法会改善检测敏感性，这样得到的PCR阳性结果就会准确表明完整病毒粒子（可能是感染性病毒粒子）的存在［26］，这可能会有助于解释PCR检测的是非感染性基因片断，还是病毒粒子。

2.3 基于探针的核酸检测方法 除了传统的PCR方法外，还有多种实时PCR（real－time PCR）方法，这些方法用的试剂变化也很大，如TaqMan、分子信标（MB）、蝎形引物、双探针、染料标记寡核苷酸连接或引物探针能量转移系统（PriProET）等。在兽医领域，实时PCR正在替代传统的PCR。PriProET是实时PCR方法中诊断能力最强的，因为PriProET需要的保守区更短，对于单个碱基突变更敏感［27－29］。另外，邻近连接技术（proximity ligation assay，PLA）是一种特殊的免疫分析方法，可用于检测目标蛋白及蛋白相互作用等。该方法通过一对标记有一段寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的单克隆或多克隆抗体的探针，即PLA探针，识别目的蛋白。当这两个探针识别同一个蛋白时，两个探针之间的距离靠近，此时通过加入一段分别与在抗体连接的DNA互补的DNA短片段，PLA探针上的DNA与该段DNA互补，然后在连接酶的作用下，PLA探针上的DNA形成一条新的DNA片段，通过荧光PCR就可以扩增并进行定量［30－31］。

2.4 深度测序分析技术 最新技术的使用，如不依赖序列的分子技术与高通量测序或基因芯片分析可能会改善并加速病毒的检测，为疫苗质量控制提供了新的方法，使目前一些未知致病因子和可疑污染因子在预先没有任何基因信息的情况下被发现。Rotarix疫苗中污染的PCV1以及Rotateq疫苗中污染的SRV核酸片段均是利用RNase／DNase消化样本，通过大规模并行测序（Massive Parallel Sequencing，MPS）结合不依赖核酸序列的分子技术以及基因芯片检验技术发现的［18］。随机PCR结合MPS和基因芯片技术与细胞培养或病原特异性PCR等现有法定方法相比，能检测出范围更广的潜在外源因子。

3 减少外源病毒污染的技术措施

为保证生物制品安全，所有起始材料和最终产品都必需检测潜在污染物。尽管如此，污染风险还不能完全排除，只是尽可能降低。对于新发现的因子并没有具体规定和检测方法，应该采取什么措施才能最大程度地提高安全性值得考虑。对于兽用疫苗，笔者建议从以下几个方面减少外源病毒污染风险：

3.1 严格按照GMP规范组织生产 兽药GMP即兽药生产质量管理规范，是兽药生产行业的质量管理执行准则，是在生产中用科学管理、规范化的条件和程序来保证生产优良药品的整套科学管理体系。疫苗生产企业必须严格按照GMP规范组织生产，对疫苗生产全过程进行质量控制，重点加强对原辅材料质量控制，制定严格的内控质量标准，认真开展原辅材料入厂检测工作。

3.2 加强对菌（种）毒和细胞库的质量控制 疫苗种子直接关系到最终产品的质量。因此，疫苗的菌（毒）种应作系统鉴定，每批基础种子均应严格按规定进行鉴定，以保证其同质性、安全性、有效性和纯净性。鉴于用新型分子技术证实原始种子污染外源因子的事件，建议对现有基础种子用基因组测序等最新分子技术进行系统鉴定，尽可能排除潜在外源因子污染。对生产和检验用细胞库，建议分析是否存在内源性逆转录病毒，并根据疫苗特性和细胞使用目的进行外源因子扩散的风险分析。对于准备注册的生物制品，在细胞库和种毒库制备环节适当采用现代分子生物学方法辅助检测等。

3.3 严格控制生产检验原材料质量 兽用生物制品的生产常用到牛血清、胰酶及牛血清白蛋白等，这些原材料具有生物活性，其生物安全较难控制。对于牛血清、细胞，不应带有BVDV、PCV、PPV等外源病毒污染。禽源细胞特别是不要污染ALV、REV及CAV等外源病毒。目前我国已强制要求兽用活疫苗生产必需用SPF鸡胚，彻底杜绝用非免疫鸡胚制备活疫苗。对于牛血清的来源，建议结合全球流行病学数据，对牛血清原产地和生产工艺等制定指导性原则，防止牛血清带来的BVDV等污染。重要生物源材料生产企业需遵循特定标准，如ISO认证等，建议疫苗生产企业采购通过认证企业生产的生物源材料。

3.4 进一步完善标准方法，提高检验水平 实施GMP以来，我国兽用生物制品企业检验水平不断提高，《兽用生物制品质量标准》中规定的大部分检验项目能够实施。近几年我国兽用疫苗的质量在不断提高，但也有部分兽用生物制品企业检验技术不够规范，检验项目不全，新增的检验项目或检验技术、检验条件要求较高的项目难以开展，检验用原材料或试剂不符合标准，如检验用鸡、鸡胚达不到SPF级。因此，需不断完善生物原材料和检验用动物标准，规范检验试剂的生产，保障检验试剂质量。建议由主管门协调官方权威实验室对外源因子检验方法、检验试剂和参考品进行比较验证，确定最佳检验方案。

3.5 开展外源因子风险评估研究 建议国家设立专项对新发因子流行情况、危害及检测方法等开展研究，并基于风险－收益评估理论制定疫苗生产中外源因子污染控制方案。

4 结语

外源病毒污染会影响疫苗的使用效果，甚至会引起生物安全问题。关注疫苗外源病毒污染，降低潜在风险，是生物制品行业和管理部门的重要责任。只有不断提高生产管理规范化程度，提高生产企业和官方实验室检验水平，建立可靠的和标准的检验体系，提高发现污染、鉴定新发外源因子的能力，才能将外源因子污染风险降至最低，保障疫苗质量和安全性。

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（编辑：李文平）

Contamination of Extraneous Virus in Viral Vaccine and Detection Methods，Purification Control Strategies

FAN Xue－zheng，LI Cui，NING Yi－bao*，QU Hong－fei
（China Institute of Veterinery Drug Control，Beijing 100081，China）

The history and present situation，convetional detection assays and new molecular assays about were reviewed in this paper.Purification control strategies including operation strictly according GMP specification，enhancing management of virus seeds，strict quality control of raw material，improving and constituting standard assays，improving test level，and carrying out some risk analysis on extraneous pathogens were suggested in order to ensure purity of vaccine.

vaccine；extraneous pathogens；detection methods；control strategies

2014－07－08

A

1002－1280（2014）11－0057－05

S859.79＋7

948项目－兽药监察关键技术引进［（2011）－G（3）］

范学政，副研究员，博士，从事动物传染病防控技术研究。

宁宜宝。E－mail：ningyibao＠ivdc.gov.cn