自噬在厄洛替尼诱导的肺腺癌细胞A549凋亡中的作用

徐 磊 赵 松 党丽峰 齐 宇 杨 洋 刘东雷 吴 恺 王啸林 鲍培龙

(郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052)

表皮生长因子受体(EGFR)是受体酪氨酸激酶(TK)HER/ErbB家族的一个重要成员，在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中均为高表达，并能通过活化下游信号转导蛋白进而调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、血管生成及转移〔1〕。研究显示〔2〕，在抗肿瘤治疗过程中EGFR-TKI厄洛替尼可诱导肺癌细胞自噬表达水平上调。自噬是细胞生长发育、成熟分化及死亡的重要调控机制，与包括肿瘤在内的多种人类疾病有关〔3～7〕。自噬可以促进肿瘤细胞的生存、转移并增加其耐药性〔8〕,目前自噬在肿瘤细胞死亡或生存当中的作用仍不清楚。本研究探讨自噬在厄洛替尼(Erlotinib)诱导的肺腺癌细胞A549凋亡中的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肺腺癌细胞株A549由河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室冻存，复苏后在含10%胎牛血清的1640培养基于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每隔3 d更换1次培养液，用胰酶细胞消化液(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化传代，取对数生长期细胞用于实验。3-甲基腺嘌呤(3-MA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品。厄洛替尼(Erlotinib,商品名:特罗凯)由罗氏公司惠赠，Acridine Orange购于Biotopped公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液购自Solarbio公司，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司生产。Beclin1及半胱氨酸蛋白酶(Caspase9)多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2MTT法检测细胞抑制率 将对数生长期A549细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔板，每孔100 μl，培养24 h，弃培养液，分别加入一系列浓度梯度的3-MA及厄洛替尼，每个浓度设3个复孔，对照组加入等体积的培养液，药物作用48 h以后每孔加入浓度为5 g/L的MTT 10 μl，于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl，振荡10 min，用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞生长抑制率=〔1-A实验组/A对照组〕×100%。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期细胞，调整细胞数为1×105个/ml，接种于6孔板中，待细胞贴壁后加入相应浓度药物作用48 h，同时设立阴性对照，离心收集悬浮细胞，用不含EDTA胰蛋白酶消化液消化收集贴壁细胞，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入400 μl AnnexinV结合液悬浮细胞，使细胞浓度约为1×106个/ml，在细胞悬液中加入5 μl AnnexinV-FITC染色液，混匀，4℃避光孵育15 min，再加10 μl PI，混匀，4℃避光孵育5 min，立即上流式细胞仪进行检测。每组实验重复3次。

1.4吖啶橙(AO)染色检测细胞自噬变化 用胰酶消化处于对数生长期的A549细胞，以1×105个/ml浓度接种于24孔板中，待细胞贴壁后，用实验浓度的Erlotinib和(或)3-MA处理细胞48 h，同时设立阴性对照组，弃培养液，加终浓度为10 μg/ml的AO室温避光孵育20 min，弃染液，PBS洗涤3次，用倒置荧光显微镜观察酸性自噬泡的变化情况并摄片。

1.5Western印迹检测细胞Beclin1和Caspase9蛋白的表达 用一定浓度的药物处理细胞48 h同时设立阴性对照，用RIPA裂解液裂解细胞，应用考马斯亮蓝，通过测定吸光度值进行蛋白质定量。制备12.5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，每孔上样量为100 μg，常规电泳，半干转膜法转膜，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加入Beclin1及Caspase9抗体(工作浓度均为1∶500)4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次，10 min/次，辣根过氧化物酶标记二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，TBST再次洗涤3次，10 min/次，之后进行增强化学发光法(ECL)检测，将结果扫描后用imagej软件进行灰度分析并进行统计学处理。β-actin为内参照。

2 结 果

2.1MTT检测结果 对于A549细胞而言，随着厄洛替尼和3-MA浓度增加细胞生长抑制率增加，厄洛替尼作用48 h时，细胞IC50值约为19.7 μmol/L，因此选用20 μmol/L作为实验剂量；3-MA作用48 h时，该细胞IC10值约为5 mmol/L,因此选用5 mmol/L作为实验剂量。

2.2AnnexinV/PI检测细胞凋亡情况 流式细胞仪检测示，3-MA组细胞凋亡率为(9.47±0.15)%，与对照组〔(3.51±0.20)%〕相比差异具有统计学意义(P<0.05)。单用厄洛替尼组细胞凋亡率为(56.35±0.71)%，与对照组相比差异显著(P<0.05)。厄洛替尼+3-MA组细胞凋亡率明显增加，为(78.40±0.52)%，与单用厄洛替尼组相比差异显著(P<0.05)。

2.3AO检测细胞自噬情况 AO可将胞质内酸性自噬泡染成红色。单用3-MA组细胞胞核呈均匀绿色荧光，单用厄洛替尼组细胞胞核呈黄绿色荧光，胞质呈点片状红色荧光，由此可见该组细胞明显发生自噬。3-MA与厄洛替尼联合作用组较单用厄洛替尼组细胞相比，红色荧光强度有所减少。说明3-MA可以抑制厄洛替尼诱导的细胞自噬现象。

2.4Western印迹结果 对照组、厄洛替尼组、3-MA组及厄洛替尼+3-MA组A549细胞Beclin1和Caspase9蛋白相对灰度值分别为0.54±0.03、0.86±0.03、0.37±0.02、0.70±0.04和0.43±0.03、0.77±0.03、0.57±0.04、0.90±0.02，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

肺癌治疗目前以手术为主，包括放化疗在内的综合治疗方案已经比较成熟，但其预后仍不理想；特别是中晚期失去手术机会的患者，无病生存率更差、更低〔9〕。近年来，以厄洛替尼为代表的靶向治疗药物在临床上显示出较好的疗效，但后期耐药又使得医生束手无策。有关研究〔10～12〕显示耐药的机制与细胞自噬有关。研究发现，自噬在肿瘤发生、发展过程中具有双重作用。作为肿瘤抑制机制，自噬可以通过诱导细胞死亡或者减少肿瘤细胞的有害突变来防止肿瘤的形成；作为肿瘤保护机制，自噬可以通过保护癌细胞免受放射线的损害和化疗药物的作用来促进肿瘤细胞的生存、转移并增加其耐药性。最近的研究表明，厄洛替尼抑制细胞内酪氨酸激酶活性可以诱导自噬〔13～15〕。

本研究结果表明，3-MA可以显著增强厄洛替尼对肺腺癌A549细胞株的杀伤作用。厄洛替尼可以诱导肺腺癌A549细胞发生自噬，而3-MA与厄洛替尼联合作用则降低了细胞的自噬水平。Caspase9是内源性凋亡通路中的关键蛋白酶，是Caspase家族中最重要的起始因子。流式细胞仪及Western印迹检测结果亦支持以上结论。Beclin1是哺乳动物Atg6的同源基因，一个与Bcl-2相互作用的蛋白，参与自噬泡的形成。结果显示3-MA组Beclin1表达减少，厄洛替尼组显著增加，而3-MA与厄洛替尼联合作用组较单用厄洛替尼组表达明显减少。综合分析以上结果，厄洛替尼可以诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡，并激活其自噬，而抑制自噬则可能通过激活内源性凋亡通路来增强厄洛替尼的细胞杀伤作用。这些结果表明，自噬抑制剂可以增强厄洛替尼的抗肿瘤作用。因此，联合使用自噬抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂有可能成为克服临床上耐药问题的一个方向，且能增强酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼的效果。

4 参考文献

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