N-乙酰半胱氨酸对铜绿假单胞菌的耐药性及绿脓菌素产量的影响

张亚妮，王世红，孙 琼，李 煜

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）是院内感染的主要病原菌之一，具有很强的耐药性。其产生的次级代谢产物绿脓菌素（pyocyanin，PCN），可改变细胞内氧化还原水平，对宿主造成氧化伤害，是导致铜绿假单胞菌感染病人死亡的主要 原 因 之 一［1－3］。N-乙 酰 半 胱 氨 酸 （N-acetylcysteine，NAC）是一种含有巯基的小分子化合物，常被作为抗氧化剂，用来改善细胞内氧化还原水平［2，4］，因此在一些临床实验中，NAC被用来治疗铜绿假单胞菌感染性疾病。但是，从目前已有的研究可以看出，NAC是否有助于铜绿假单胞菌感染性疾病的治疗还没有一致的观点，具体机制也并不清楚。在本研究中，为了进一步明晰NAC与铜绿假单胞菌感染性疾病的关系，我们研究了NAC与铜绿假单胞菌的耐药性和毒性分泌关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 抗生素：卡那霉素（kanamycin sulfate，Kan）、氯霉素（chloramphenicol，Cm）、庆大霉素（gentamycin sulfate，Gm）、红霉素（erythromycin，Em）购自 Amresco公司；四环素（tetracyclin HCl，Tet）、氨苄青霉素（ampicillin，Amp）、硫酸链霉素（steptomycin sulfate，Strep）购自 Genview公司。酵母粉与蛋白胨购自OXOID公司；NAC购自Sigma公司。

1.2 细菌、培养基及培养条件 本研究所用铜绿假单胞菌为实验室保存的野生型菌株PAO1。LB培养基和PIA培养基按常规方法配置。37℃培养菌体，液体培养时，摇床转速为 200 r·min－1。

1.3 抗生素抑菌活性测定 抑菌活性测定按照文献［5］方法，采用琼脂扩散法测定抑菌圈大小和最小抑制浓度（MIC）两种方法。

1.4 绿脓菌素（PCN）的测定 按照文献［6］所述测定。

2 结果

2.1 NAC影响抗生素对铜绿假单胞菌的抗菌活性 NAC配制成50 g·L－1储备液，过滤灭菌存放在－20℃条件下。在本研究中，选用7种不同的抗生素，分别为Kan、Gm、Cm、Tet、Amp、Em、Strep，这些抗生素可作为一些主要类别抗生素的代表。用滤纸片琼脂扩散法和MIC法测定NAC影响铜绿假单胞菌对不同抗生素的敏感性变化。结果显示，在LB培养基中添加1 g·L－1的NAC后，与对照组比较，NAC可以降低铜绿假单胞菌对Gm、Em、Kan和 Strep的敏感性，增加对Cm、Amp、Tet的敏感性。在 1g·L－1的 NAC存在条件下，Kan的 MIC从 120 mg·L－1上升到 480 mg·L－1，Strep的MIC从12.5 mg·L－1上升到125 mg·L－1，而 Cm的 MIC从30 mg·L－1下降到6 mg·L－1，Tet的 MIC从8 mg·L－1下降到 2.5 mg·L－1。

2.2 NAC对铜绿假单胞菌绿脓菌素产量的影响 PCN是铜绿假单胞菌分泌的一种蓝绿色次级代谢产物，是重要的致病因子和促炎介质。为了了解NAC对PCN的影响，在铜绿假单胞菌液体培养过程中添加1g·L－1的NAC，发现加NAC的培养液颜色与对照组颜色差别很大，对照组可明显看到蓝绿色的PCN产生，而加NAC的培养液颜色较淡。对PCN的产量进行测定，结果发现，PAO1的平均PCN产量为2.9 mg·L－1，而在培养过程中加 NAC后，PCN产量明显下降到1.86 mg·L－1。这表明NAC可以降低铜绿假单胞菌的PCN产量。

3 讨论

对于NAC等抗氧化剂在治疗铜绿假单胞菌感染性疾病过程中，是否起到积极地作用，存在不同的研究结果。铜绿假单胞菌感染的囊性纤维化病人和慢性肺病病人口服和吸入雾化的NAC可以明显改善肺部和支气管的感染症状［7－9］，改善最大呼气流速率、最大肺活量和最大呼气流量容积［10］。但 Decramer等［11］研究认为，NAC对于阻止肺功能恶化和病情加剧是无效的。Stey等［12］对公开发表文献中2011个口服NAC的病人进行了统计，分析NAC是否有助于病情的缓解及治愈，结果发现，口服NAC可以降低病情加重的风险，改善慢性支气管炎的症状。在本研究中，我们发现NAC对抗生素的抑菌作用有很大程度的影响，并且能够明显降低PCN的产量。因此，NAC用于铜绿假单胞菌感染病人的治疗应该是有益的，但是与抗生素联合用药时，要考虑NAC对不同抗生素抑菌能力的改变。本研究结果为NAC的临床联合用药提供了有力的科学支撑，并为后续研究NAC工作提供一定的思路和参考价值。

参考文献：

［1］ Price-Whelan A，Dietrich L E，Newman D K.Rethinking‘secondary’metabolism：physiological roles for phenazine antibiotics［J］.Nat Chem Biol，2006，2（2）：71－8.

［2］ Repine JE，Bast A，Lankhorst I.Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease.Oxidative Stress Study Group［J］.Am J Respir Crit Care Med，1997，156（2 Pt 1）：341－57.

［3］ Lau G W，Hassett D J，Ran H，et al.The role of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa infection［J］.Trends Mol Med，2004，10（12）：599－606.

［4］ Fink M P.Role of reactive oxygen and nitrogen species in acute respiratory distress syndrome［J］.Curr Opin Crit Care，2002，8（1）：6－11.

［5］ 张亚妮.谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性及抗生素抗性的关系研究［D］.西北大学，2009.

［5］ Zhang Y N.The Roles of Glutathione in Pseudomonas aeruginosa Pathogenicity and Antibiotic Resistance［D］.Northwest University，2009.

［6］ Essar D W，Eberly L，Hadero A，Crawford I P.Identification and characterization of genes for a second anthranilate synthase in Pseudomonas aeruginosa：interchangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implications［J］.J Bacteriol，1990，172（2）：884－90.

［7］ Tirouvanziam R，Conrad C K，Bottiglieri T，et al.High-dose oral N-acetylcysteine，a glutathione prodrug，modulates inflammation in cystic fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（12）：4628－33.

［8］ Kao L W，Kirk M A，Furbee R B，et al.What is the rate of adverse events after oral N-acetylcysteine administered by the intravenous route to patients with suspected acetaminophen poisoning？［J］.Ann Emerg Med，2003，42（6）：741－50.

［9］ Zuin R，Palamidese A，Negrin R，et al.High-dose N-acetylcysteine in patients with exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Clin Drug Investig，2005，25（6）：401－8.

［10］ Stafanger G，Koch C.N-acetylcysteine in cystic fibrosis and Pseudomonas aeruginosa infection：clinical score，spirometry and ciliary motility［J］.Eur Respir J，1989，2（3）：234－7.

［11］Decramer M，Rutten-van Molken M，Dekhuijzen P N，et al.Effects of N-acetylcysteine on outcomes in chronic obstructive pulmonary disease（Bronchitis Randomized on NACCost-Utility Study，BRONCUS）：a randomised placebo-controlled trial［J］.Lancet，2005，365（9470）：1552－60.

［12］Stey C，Steurer J，Bachmann S，et al.The effect of oral N-acetylcysteine in chronic bronchitis：a quantitative systematic review［J］.Eur Respir J，2000，16（2）：253－62.