骨质疏松症动物模型的制作与评价＊

付小卫，宋长恒，刘梅洁，于 峥，赵宏艳，张治国，张方珍，李岳泽

(1.陕西中医学院第二临床医学院，陕西咸阳 712046;2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少或(和)骨组织微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病，表现为骨强度下降、骨脆性增加，从而极易发生骨折。骨质疏松症及由其引起的骨折等并发症，对中老年人尤其是绝经后妇女的身体健康和生存质量构成了严重威胁，并极大地增加了社会和家庭的经济和生活负担。近20多年来，中医药工作者在大量临床实践经验的基础上，开展了广泛的防治骨质疏松症的实验研究工作，取得了较大的研究成果。本文简述中医药科研中各种骨质疏松症动物模型的制作方法并进行评价。

1 去势法

去势法分为雌性去卵巢法和雄性去睾丸法。

1.1 去卵巢法

此法是20世纪60年代末由Saville利用实验大鼠首次建立的［1］，目前已成为研究绝经后骨质疏松症的经典模型之一。大鼠双侧卵巢切除后的骨丢失，与妇女绝经或卵巢切除后的骨丢失极为相似，都是由于体内雌激素水平迅速降低，使其对成骨细胞的促成熟功能和对破骨细胞的抑制功能减弱，使骨代谢呈现负平衡，即骨吸收和骨形成都明显增加，但骨吸收功能大于骨形成功能，以骨丢失为主，进而启动了骨的合成，属高转换型骨质疏松。

邝志强等［2］用6月龄雌性SD大鼠切除双侧卵巢8周后进行干预，干预12周后采用双能X线检测大鼠BMD，ELISA法检测血清 RANKL、OPG含量，real-time PCR检测大鼠骨组织RANKL、OPGmRNA表达。实验结果显示，与sham组比较，OVX组大鼠BMD降低，血清RANKL含量增加，OPG降低，骨组织RANKL mRNA表达增加，OPG mRNA表达减少。

1.2 去睾丸法

去睾丸大鼠骨质疏松动物模型是研究男性骨质疏松的重要工具。大量临床资料证实，成年男性手术或药物去势造成的雄激素迅速降低，致使骨转换增加骨量丢失，而激素替代疗法可以逆转这一状况。雄激素具有抑制骨吸收促进骨形成的作用，主要是通过直接作用于成骨细胞上的雄激素受体和经芳香化酶作用转变为雌二醇发挥作用。另外，雄激素缺乏也可减少降钙素的分泌量，进而间接引起破骨细胞活性增加。

苏开鑫等［3］对4月龄SD雄性大鼠切除睾丸90 d后观察发现，去睾丸组大鼠胫骨上端骨量下降，骨形成和骨吸收参数都增加，骨代谢呈高转换型，同时腰椎也出现骨质丢失。

近年的研究也表明，雌激素在维持男性骨代谢平衡方面有着重要作用。切除睾丸后造成的骨量减少、骨质疏松，到底是雄激素还是雌激素缺乏引起的，目前观点尚不一致，有待今后深入研究探析。

2 给药法

2.1 糖皮质激素

大量临床资料证实，长期或大量使用糖皮质激素可以引致骨质疏松且并发骨折。其发生机制是超生理剂量的糖皮质激素可显著抑制松质骨的骨形成，增加骨吸收，使骨代谢呈现负平衡，进而导致OP，常用药物有地塞米松、泼尼松龙等。赵旭等［4］采用此法造模研究左归丸治疗OP的效应机制，给予SD大鼠地塞米松1 mg/kg肌肉注射，每周2次，连续8周，结果显示模型组血清碱性磷酸酶升高，腰椎骨生物力学性能下降，股骨骨矿含量、BMD均下降，而中药左归丸可对以上指标有逆转改善作用。

2.2 维A酸

维A酸又称维甲酸，是体内Vitamin A的代谢中间产物，临床上主要用于治疗肿瘤和银屑病等，但其有致骨质疏松的副作用。有文献报道［5］，此药既有促进成骨细胞增殖和分化作用，又能增加破骨细胞的骨吸收，故而可造成骨形成与骨吸收都活跃的高转换型OP。西安交通大学许鹏等［6］研究表明，给予维甲酸15 d时模型组大鼠血清雌二醇水平明显降低，其机制有可能是损伤大鼠卵巢，使雌激素分泌减少，进而减低对破骨细胞的抑制作用，造成骨吸收明显增强。

2.3 D-半乳糖

1985年，有学者［7］运用其建立衰老模型。后研究发现，D-半乳糖可致雄性大鼠发生骨质疏松，主要机制是其可损害雄性大鼠的睾丸，使雄激素降低。戴娟秀等［8］研究指出，D-半乳糖大量在细胞内堆积可使细胞渗透压升高、脆性增加，并可产生大量氧自由基，进一步使细胞老化和功能减退，在雄性大鼠实验中，可使大鼠睾丸支持细胞和生精细胞发生损伤，血清睾酮下降，从而使破骨细胞活性增加，抑制钙的肠吸收并增加钙磷排泄，最终导致OP，但D-半乳糖对雌性大鼠不能导致骨质疏松［9］。

2.4 环磷酰胺

环磷酰胺是一种烷化剂，具有明显的抗癌和免疫抑制作用，临床多用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、淋巴细胞白血病等肿瘤性疾病和变态反应性疾病。其作用机制可能与其免疫抑制作用、促进骨钙释放、抑制骨羟脯氨酸的合成及骨钙的沉积有关，因而此法建立的OP模型具有骨矿物质和骨基质等比例减少的特点。曹胜男等［10］采用此法进行造模研究，给予小鼠此药20 mg/(kg·d)连续灌胃，2周即可使小鼠骨干重减少，股骨长和横径减少，骨矿物质和骨基质同时减少，建立OP模型。

2.5 谷氨酸单钠

谷氨酸单钠俗称味精，是对健康有害的食品添加剂之一。作为一种中枢兴奋性神经递质，大量文献证实其具有神经毒性作用，给新生期大鼠皮下注射谷氨酸单钠可损毁下丘脑弓状核而导致骨质疏松。钟平等［11］给予新生期SD雌性大鼠皮下注射10%谷氨酸单钠，4个月后进行骨组织形态计量学检测，结果显示实验组与生理盐水对照组比较，骨形成减少，骨吸收增加，骨量减少，导致骨质疏松发生。

3 营养干预法

此法主要是控制动物饲料中钙和蛋白的含量。钙是骨骼的基本成分，人体中99%的钙存在于骨骼中。长期的低血钙可使机体处于负钙平衡状态，从而继发引起甲状旁腺功能亢进，PTH分泌增多，导致骨量丢失，发生OP。流行病学调查显示［12］，人群中蛋白质摄入量与骨密度呈显著负相关，其主要原因是高蛋白摄入使尿中固定酸含量增加，肾近曲小管对钙的重吸收减少，从而使钙从尿液中流失增加。

复旦大学王烨明等［13］通过采用对3周龄SD大鼠摄食低钙高蛋白饲料造模，6个月后实验组大鼠即出现骨小梁面积减少、变窄、间距增宽、断裂，骨代谢提示破骨细胞活性显著增加，成骨细胞功能也变活跃，呈现高转换骨质疏松。

4 疾病并发症

4.1 糖尿病性

流行病学调查表明，糖尿病患者易发生骨质疏松。其发生机制主要有胰岛素缺乏、糖代谢紊乱、微血管病变3方面，以及胰岛素对骨的影响通过直接作用或由生长因子(IGF-1)介导。薛昊罡等［14］研究AGEs对糖尿病大鼠骨质疏松的作用机制，取SD大鼠腹腔内注射STZ，诱导建立糖尿病骨质疏松动物模型，结果显示模型组大鼠的骨组织形态计量学参数静态指标和动态指标与对照组比较差异有统计学意义，呈现骨质疏松表现。

4.2 肝硬化性

近年来临床观察发现［15］，胆汁瘀积性肝病可并发骨质疏松，其发生机制尚未完全明了，目前认为与肝内胆汁瘀积使肠腔内胆盐减少，引起维生素D、钙吸收障碍有关。邹丽宜等［16］用四氯化碳致小鼠肝纤维化制造肝硬化模型，测定右股骨干重和股骨总钙含量减少，提示有骨量丢失，同时血清白蛋白明显减少，球蛋白明显增加，此骨量丢失或许与蛋白紊乱有某种联系。

4.3 酒精中毒性

长期过量饮酒所致的酒精中毒可引发骨质疏松，属于低转换型骨质疏松症［17］。酒精可影响骨代谢，使骨吸收增强，骨形成减少、骨量降低而引发OP。任树军等［18］给予雄性SD大鼠红星二锅头灌胃法造模，16周后取材行双能X线骨密度仪检测左侧股骨BMD和BMC，结果二者均明显低于正常对照组，说明造模成功。

5 制动法

临床观察发现，某些疾病患者因为运动受限和功能障碍一段时间后，可出现骨矿含量减少、骨小梁变细，甚至关节疼痛、变形、驼背、脊柱侧弯等骨质疏松表现，可称之为失用性骨质疏松。据此，可以制作OP动物模型用于科学研究，常用的方法有腿-尾固定法、尾掉法、坐骨神经切断法等。华西医院唐学阳等［19］通过腿-尾固定法对4周龄SD雄性大鼠进行制动法建立OP模型，制动2周和4周后幼鼠右后肢股骨的湿重和灰重、股骨和胫骨BMD均低于同龄对照组。另外，制动2周时出现右侧胫骨骨小梁稀疏，制动4周可见纽扣样改变，髓腔增大。

6 基因敲除法

基因敲除技术是20世纪80年代创立的一门新技术，是采用一定方式在体外构建载体，通过同源重组的方式删除1个基因，此基因结构已知功能未知，从而在细胞水平或动物水平观察研究该基因的功能［20］。上世纪末即有报道［21］，利用骨保护素(OPG)基因敲除纯合子小鼠可表现出严重的骨质疏松症。近年来，国内学者也多有运用此法建立OP模型进行研究，如上海中医药大学程少丹等［22］采用频密繁殖法获得OPG基因敲除小鼠进行骨质疏松研究，发现其表现出明显的骨质疏松，是一种理想的骨质疏松模型动物。

［1］Saville PD.Changes in skeletal mass and fragility with castration in the rat:a model of osteoporosis［J］.Am Geriatr Soc，1969，17(2):155-166.

［2］邝志强，张荣华.运动联合阿仑膦酸钠片对去卵巢大鼠RANKL/OPG平衡及MAPK信号通路的影响［J］.第二军医大学学报，2013，34(8):857-862.

［3］苏开鑫，陈艳，等.增龄和去睾丸大鼠不同结构骨组织的变化及雄激素的干预作用［J］.中国现代医学杂志，2008，18(22):3286-3289.

［4］赵旭，代平，等.经方左归丸抗糖皮质激素性骨质疏松症的效应及机制研究［J］.时珍国医国药，2009，20(9):2243-2244.

［5］朱虎虎，孙炜，等.维甲酸诱导雌性大鼠骨质疏松模型建立的效果观察［J］.当代医学，20013，19(14):24-26.

［6］许鹏，郭雄，等.维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠的效果及机理［J］.四川大学学报(医学版)，2005，36(2):229-232.

［7］龚国清，徐黻本.小鼠衰老模型的研究［J］.中国药科大学学报，1991，22(20):101-105.

［8］戴娟秀，吴铁.仙灵骨葆对D-半乳糖致雄性大鼠骨质疏松骨量的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2008，16(8):32-34.

［9］罗红梅，崔燎，等.D-半乳糖性雄性大鼠骨和睾丸微细结构的变化［J］.中国新医药，2004，3(2):15-18.

［10］曹胜男，包海鹰，等.鹿角盘不同提取部位对环磷酰胺致小鼠骨质疏松的防治作用［J］.中国兽医学报，2013，33(4):597-599.

［11］钟平，刘浩宇，刘锡仪.谷氨酸单钠损毁弓状核对雌性大鼠骨组织形态计量学的实验研究［J］.中国现代医药杂志，2010，12(6):1-4.

［12］Lau EM，Woo J.Nutrition and osteoporosis［J］.Curropin Rheumatol，1998，10(4):368.

［13］王烨明，施德源，陈统一.低钙联合高蛋白饲料对大鼠松质骨与代谢的影响和机制［J］.复旦学报(医学版)，2003，30(5):484-486.

［14］薛昊罡，冷冰，等.AGEs对糖尿病大鼠骨质疏松的作用机制［J］.中国老年学杂志，2011，5(31):1808-1811.

［15］Gonzalez SAP，Munoz NF，Erdozain Sosa JC，et al.Bone metabolism in non-cholestatic chronic hepatopathy［J］.MedClin(Barc)，1998，111(12):446-450.

［16］邹丽宜，吴铁.小鼠肝硬化导致骨丢失及人参茎叶皂苷的防治作用［J］.药学学报，2001，36(12):886-890.

［17］任树军，邢国利，于雪峰，等.酒精性骨质疏松症的研究概况［J］.中医药信息，2008，25(4):12-15

［18］任树军，邢国利，等.补肾健脾益气法对酒精性骨质疏松大鼠骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)影响的研究［J］.中医药学报，2013，41(1):24-26.

［19］唐学阳，刘利君，等.废用性骨质疏松幼龄大鼠骨维生素D受体表达的研究［J］.四川大学学报(医学版)，2010，41(1)106-110.

［20］陈系古，都同功.基因打靶技术在转基因动物中的进展［J］.中国实验动物学杂志，1997，7(1):47-50.

［21］Mizuno A，Amizuka N，Irie K，et al.Severe osteoporosis in mice lacking osteoclastogenesis inhibitory factor/osteoprotegerin［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，247:610-615.

［22］程少丹，王拥军，等.OPG基因敲除小鼠骨质疏松情况的研究［J］.中国骨质疏松杂志，2008，14(1):16-19.