柴胡皂苷B2（Saikosaponin B2）对四氯化碳损伤HepG2细胞的保护作用

崔 哲沈光海*

（1 延边大学附属医院，吉林 延吉 133000；2 延边大学药学院，吉林 延吉 133000）

柴胡皂苷B2（Saikosaponin B2）对四氯化碳损伤HepG2细胞的保护作用

崔 哲1沈光海2*

（1 延边大学附属医院，吉林 延吉 133000；2 延边大学药学院，吉林 延吉 133000）

目的初步探讨柴胡皂苷 B2（SSB2）对CCl4肝细胞损伤的保护作用。方法用CCl4诱肝HepG2细胞损伤，设立正常对照组、CCl4损伤组和不同浓度SSB2保护组；利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力以及流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的方法，观察SSB2对CCl4诱导的肝细胞损伤的保护作用。结果MTT检测显示SSB2保护组细胞活性明显高于损伤组，以SSB2浓度为100 μg/mL保护组细胞活性最高 ；流式细胞仪测定细胞凋亡率显示SSB2保护组 （终浓度为100 μg/mL）凋亡率明显低于CC14损伤组，细胞周期各期细胞分布比例无明显变化。结论SSB2对CCl4诱导的HepG2细胞损伤具有保护作用。

北柴胡；柴胡皂苷B2；HepG2细胞；细胞凋亡；肝保护作用

为了探讨北柴胡中分离得到的SSB2对体外培养肝细胞损伤保护作用，在CCl4损伤的HepG2细胞模型上，用MTT检测细胞活性和流式细胞仪分析的方法探讨SSB2对肝细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料：HepG2细胞株（延边大学重点实验室提供），ARX300型核磁共振波普仪（德国 Brucker公司产品），RPMI1640培养基、胎牛血清、MTT（购自Gibco公司），SONRISE-BASIC TECA酶标仪（瑞士Sunrise公司产品），FAC Scan型流式细胞检侧仪（美国BD公司产品）。

1.2 方法

1.2.1 提取分离：取北柴胡干燥根2.0 kg，用乙醇室温提取3次，每次7 d，减压浓缩得浸膏153.0 g。将浸膏悬浮于水中，依次用CH2Cl2、EtOAc、BuOH萃取，其中BuOH层减压浓缩后得到浸膏10.5 g，将BuOH浸膏10 g上正、反相硅胶柱层析、LH-20柱层析及甲醇重结晶得到白色粉末25.0 mg，其核磁共振数据与文献[1]报道SSB2数据一致，确定此化合物为SSB2。

1.2.2 HepG2细胞培养：含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下静置培养。当汇合度95%以上时，行细胞传代分组试验。

1.2.3 CCl4损伤液制备：DMSO与CCl4以物质的量比1∶2混匀，加入到RPMI 1640培养液中（最终浓度为0.4 μmol/μL），得到CCl4混悬液，4 ℃冰箱保存。用前震荡后使用。

1.2.4 分组实验：设正常对照组、CCl4损伤组和SSB2损伤保护组。正常对照组不做处理；损伤组加入CCl4混悬液（最终浓度为6 μmol/mL）；SSB2损伤保护组分五组SSB2浓度分别为（50、100、150、200、300 μg/mL），于CCl4损伤前12 h加SSB2。三组细胞均于37 ℃、5% CO2静置培养（饱和湿度）。

1.2.5 MTT法检测细胞活力：将HepG2细胞以5×104/mL接种在96孔培养板中，每孔100 μL。培养12 h后，保护组加入不同浓度的SSB2，继续培养12 h，加入CCl4（浓度最终为6 μmol/mL），正常对照组不做处理。每组设6个复孔。损伤2 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放人CO2培养箱继续培养4 h，取出培养板，小心吸去培养液，加入100 μL DMSO，振摇至MTT结晶溶解后，用全自动酶联仪测定各孔吸光度（OD值）（测试波长570 nm）。并计算实验组细胞存活率，细胞存活率：OD实验/OD对照×100%（以空白组OD值调零）。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞活性：HepG2细胞以×104个/mL接种于培养瓶中，随机分为三组（对照组、保护组、损伤组），每组2瓶。细胞培养48 h，换液，每瓶精确定量加入4.0 mL培养液，保护组加入SSB2（浓度最终为100 μg/mL）。静置培养12 h，损伤组和保护组加入CCl4（浓度最终为6 μmol/mL）继续培养4 h，分别收集各瓶培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，加入原培养液吹打分散细胞，1000 rpm/min离心8 min收集细胞.PBS清洗3次后，用500 μL PBS悬浮细胞，加入含10 μg/mL的RNase的PI，4 ℃染色30 min，经200目过滤后上机检测. 1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 MTT检测数据统计分析：保护组OD值明显高于损伤组，SSB2 100 μg/mL组OD值达最高峰，以后随着SSB2浓度的增加，OD值下降其保护作用与剂量和作用时间相关。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率：正常组细胞凋亡率为 0，损伤组凋亡率为40.28%，损伤保护组（SSB2浓度为100μg/mL）凋亡率为9.02%。各组细胞G1、G2、S期细胞分布变化很小，SSB2对CCl4损伤HepG2细胞有明显的保护作用，对细胞周期没有影响。

3 讨 论

北柴胡（Bupleurum Chinense DC.）为伞形科（Umbelliferae）柴胡属植物，具有和表解里及疏肝理气之功效[2]。北柴胡主要有效成分有柴胡皂苷、柴胡醇、挥发油、三萜苷类及黄酮类等[3]，大量药理与临床研究证明SSB2具有多种药理活性，具有抗炎、细胞毒、增强免疫、抑制脂肪分解、刺激PGE2的合成等多种作用[4,5]。目前，SSB2对肝细胞损伤保护作用方面的研究很少，HepG2细胞株与人正常肝细胞有许多共同生理功能，是较理想的肝细胞替代物。因此，本实验以HepG2细胞株为研究对象，在CCl4损伤的HepG2细胞模型上初步探讨SSB2对肝细胞损伤保护作用研究.

本研究结果表明，SSB2对CCl4损伤具有显著的保护作用；流式细胞检测结果显示，SSB2保护组细胞凋亡率较损伤组下降77.59%，对细胞周期影响很小，MTT比色分析细胞活性结果显示，保护组细胞活性显著大于损伤组。提示SSB2对CCl4导致的肝细胞损伤具有显著的保护作用，SSB2最佳保护浓度为100 μg/mL，为进一步开发利用北柴胡资源和研究SSB2对肝细胞损伤的保护作用和机制提供了实验依据。

[1] 刘沁舡,谭利.柴胡属皂苷近十年研究概况[J].中国中药杂志,2002, 27(1):7.

[2] Delectis Florae Reipublicae Poularis Sinicae,Agendae Academiae Sinicae Edita.Flora reipublicae popularis sinica[M]. Tomus55.Beijing:Science Press,1979:7.

[3] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海人民卫生出版社,1977:3763.

[4] Tsaiy J,Chen IL,Horng LY,et al.Induction of differention in rat C6 glioma cells with Saikosaponins [J].PhytotherRes,2002,16(2): 117.

[5] 谢东浩,蔡宝昌.柴胡皂苷类化学成分及药理作用研究进展[J].南京中医药大学学报,2007,23(1):63-65.

R282

B

1671-8194（2014）22-0082-02

吉林省中医药管理局项目（编号：2010-152）

*通讯作者