内阿米巴属原虫分子检测及基因分型方法研究进展

董海聚，王荣军，张龙现

阿米巴原虫属于肉足鞭毛门、肉足亚门、跟足总纲、叶足纲、阿米巴目的成员，根据其生活环境不同分为内阿米巴和自由生活阿米巴，前者寄生于人和动物，主要有4个属，即内阿米巴属(Entamoeba)、内蜒属(Endolimax)、嗜碘阿米巴属(Iodamoeba)和脆双核阿米巴属(Dientamoeba)；后者生活在水和泥土中，偶尔侵入动物机体，主要有5个属，即耐格里属(Naegleria)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、哈曼属(Hartmannella)、Vablkampfia属和Sappinia属。其中内阿米巴属原虫可引起人和动物出现痢疾和肝脓肿等症状，危害较为严重，据报道溶组织内阿米巴原虫(Entamoebahistolytica，E.histolytica)每年可引起5 000万人发生阿米巴痢疾和肝脓肿，可导致10万人死亡[1]，因此，引起了国内外研究者的高度关注。20世纪早期，内阿米巴属原虫的命名大多是根据其感染的宿主以及其包囊或滋养体形态的差异而定，目前已知命名的种类有E.histolytica、E.dispar、E.moshkovskii、E.coli、E.polecki、E.hartmanni、E.bovis、E.ovis、E.dilimani和E.suis等，其中，感染人的主要包括E.histolytica、E.dispar、E.moshkovskii、E.coli、E.polecki和E.hartmanni，且主要寄生于人的小肠，目前认为E.histolytica是唯一有根据被确定为致病性的内阿米巴原虫，而且被认为是引起人死亡的主要寄生虫之一[2-3]，E.polecki一般不致病，但也有少数人出现腹泻症状的报道。不同种类的内阿米巴原虫包囊和滋养体的形态极为相似，E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii的滋养体直径约10～50 μm，包含1个单核，包囊直径约10～15 μm，包含1～4个核，未成熟包囊有1～2个核，成熟包囊具有4个核，从形态上难以区分；E.hartmanni包囊直径小于10 μm，从形态上能与E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii进行鉴别，但有时一些E.hartmanni包囊直径会大于10 μm，如严格根据形态进行区分，可能会误认为E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii；E.coli包囊直径10～30 μm，而且核的形态与E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii有所不同，前者的内含体常偏离中央，后者位于中央，前者的核膜染色质内衬更加粗糙，上面的颗粒更大；E.polecki包囊为单核，仅有1%的包囊处于2个核的发育阶段。

理论上来讲，能够根据包囊或滋养体的形态将一些内阿米巴原虫区分，但在实际操作过程中很难区分，尤其是E.histolytica、E.dispar和E.moshkovskii，再加上检测方法等方面的因素，以前的报道盲目扩大了E.histolytica的感染率，因此，目前主要通过分子诊断方法对其进行种类的鉴定和基因分型。

1 常规检测方法

在分子生物学技术发展的早期，研究者主要使用酶谱型和抗原检测来确定内阿米巴原虫的感染情况。

1.1酶谱型 酶谱型技术是最早应用于区分内阿米巴原虫分离株的方法，并且长期作为区分其分离株的金标准，该法的缺点是必须使用培养的滋养体、耗时和敏感性极低，因此，目前很少被采用，但该法在早期对E.histolytica和E.dispar的区分起到了重要的作用[4]。

1.2抗原检测 目前用于抗原检测的肠道内阿米巴原虫主要是E.histolytica，其特异性检测主要使用商品化的检测试剂盒，但选用的单抗主要是针对同一抗原决定簇：E.histolytica的Gal/GalNac特异性植物凝集素。孟加拉国E.histolytica高度传播区的一些研究显示抗原检测的敏感性与PCR检测结果相似[5]，非高度传播区研究显示其敏感性远远低于PCR检测结果，到目前为止，在E.histolytica高发区适合抗原检测，但在非高发区效果不佳[6]。

2 分子检测方法

最早用于区分E.histolytica和E.dispar的方法包括两种普通PCR，主要基于核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)[7]和编码过氧化物酶(30-kDa 蛋白)的基因[8]，且这些技术已广泛应用于世界各地。目前，用于鉴定和区分E.histolytica和E.dispar的一些更新的方法正在应用，主要包括双重、多重、巢式和实时定量PCR等，另外，还发展了大量用于检测E.moskhovskii的方法[9-10]。

2.1普通PCR 在发达国家，PCR方法多用于临床和流行病学研究，而且已经被WHO高度认可。采用PCR方法已经在不同的临床样品(如粪便、组织和肝脓肿穿刺物)中检测到了肠道内阿米巴原虫。据报道，基于SSU rRNA的PCR检测敏感性大约是最好的ELISA试剂盒检测的100倍[11]。Edman等[12]用PCR扩增编码125 kDa的表面抗原，这种方法后来配合限制性片段多态性分析用于区分不同种类的内阿米巴原虫[13]，但这些研究所用的DNA均从实验室保存的阳性样品中提取。

目前有许多针对不同基因的PCR方法用于检测和区分E.histolytica/E.dispar/E.moshkovskii，如SSU rRNA、HLY6基因、编码30-kDa蛋白基因等。由于在E.histolytica和E.dispar的SSU rRNA之间存在着稳定的遗传偏差，因此，SSU rRNA已成区分虫种的一个重要靶基因[7]。通过从培养的滋养体和镜检阳性样品中直接提取的DNA进行PCR扩增证明SSU rRNA可用于检测内阿米巴原虫，具有很好的敏感性和特异性。由于SSU rRNA具有多拷贝性，且存在于内阿米巴原虫染色体外质粒中[14]，使其比单拷贝基因的DNA片段更易检测，目前已广泛应用于内阿米巴原虫的检测和区分。

有人根据29-kDa/30-kDa抗原基因设计引物，利用传统PCR扩增来区分致病性和非致病性内阿米巴原虫[8]，该目的基因可用于分析实验室内培养的经显微镜检查确认的阳性粪便样品，也可用于实验室培养物和被福尔马林固定的粪便样品的检测[15]。

用于PCR扩增的其他目的基因包括两个蛋白质编码基因，这两个基因在其编码区具有多态性，即富含丝氨酸的E.histolytica蛋白基因(SREPH)[16]和甲壳素基因[17]，有人利用镜检阳性粪便DNA进行基于SREPH基因的巢式PCR扩增曾感染一人群的E.histolytica的差异[18]，SREPH作为目的基因也已用于实验室培养物和通过硫酸锌梯度漂浮浓集后的镜检阳性粪便DNA的PCR扩增[19]。

应用半胱氨酸蛋白酶基因和肌动蛋白基因作为目的基因的PCR也曾用于阿米巴病的流行病学研究[20]。另外，基于E.histolytica溶血素基因HLY6的PCR检测也已发展用于粪便和肝脓肿样品中E.histolyticaDNA 的检测，而且敏感性和特异性均为100% (hemo-PCR)[21]。

为提高PCR检测的敏感性，有人用巢式多普勒PCR对粪便镜检阳性样品中的DNA进行检测并区分E.histolytica和E.dispar，利用这种多普勒技术，其敏感性和特异性分别为94%和100%[22]，此法也已成功应用于检测福尔马林固定样品中的E.histolytica和E.dispar。利用与生物素探针结合的特异性引物扩增E.histolytica和E.dispar的染色体外环状DNA，PCR-ELISA结果表明在临床样品中检测和区分这两种内阿米巴原虫敏感性较高[23]。

也有研究者利用PCR技术对肝脓肿样品中的内阿米巴原虫进行检测，首次用编码30-kDa抗原基因对肝脓肿样品中提取的DNA进行E.histolytica的PCR检测，敏感度为100%。也有人用同样的引物，发现敏感度仅33%，而使用另一对针对30-kDa抗原基因的特异性引物，敏感度可达100%。为验证使用不同引物进行的PCR检测结果，有人用10种以前发表的不同的引物(用来扩增肝脏和粪便中的E.histolyticaDNA)直接扩增检测肝脓肿脓汁中的E.histolyticaDNA[24]，在这10种引物中，针对E.histolytica的染色体外环状DNA的引物p1-p2和针对30-kDa抗原基因的引物p11-p12敏感性为100%；基于溶血素基因HLY6的hemo-PCR用于检测肝脓肿样品，其阳性率达89%，30-kDa抗原基因和18SrDNA的PCR扩增，阳性率分别为77%和28%[21]，因此，Hemo-PCR成为检测肝脓肿和粪便样品中E.histolytica的一种非常有价值的诊断工具。

对于粪便中的E.moshkovskii的检测，Haque等首次报道了指纹分析的方法[5]，随后，发展了基于SSU rRNA的巢式PCR扩增后进行限制性内切酶消化的方法对其进行鉴定[9]，通过这种方法对采用QIAGEN粪便提取试剂盒直接从粪便中提取的DNA进行检测，敏感性和特异性均达100%[25]。

尽管应用PCR技术检测这些内阿米巴原虫已经非常成功，但在常规诊断中推广应用却非常有限，其中的重要原因是粪便中DNA的提取困难，而且，DNA的扩增和检测耗时，费钱，另外，环境和临床样品中产生的非特异性DNA片段经常会导致假阳性结果的产生。

2.2实时定量PCR 实时定量PCR具有可消除PCR扩增后的分析、缩短循环次数、减少实验室扩增产物的污染和降低试剂成本等优点，很适合实验室诊断。研究者已开始用不同的实时定量PCR对E.histolytica和E.dispar进行鉴别诊断，包括应用杂交探针检测SSU rRNA扩增产物的Light cycler法和两种Taqman法，其中一种是针对SSU rRNA，另一种针对游离基因重复片段的检测，所检测样品均为非人灵长类和人粪便样品中提取的DNA[26]。已有报道用针对SSU rRNA片段的信标实时定量PCR检测粪便和肝脓肿样品中的E.histolytica[27]。Qvarnstrom等报道了基于18S rRNA的荧光染料定量PCR检测方法[28]，在这些定量PCR研究中大多数选择的靶序列都是rRNA，通过对3种定量PCR方法进行了评价，强调了每种方法的优缺点，以及在临床诊断中的应用，该研究还强调了不同检测方法的局限性和检测性能的主要区别，但该研究中的Light Cycler和针对游离基因的Taqman检测法不能用于区分E.histolytica和E.dispar[26]。随后出现了针对不同肠道寄生虫检测的敏感性和特异性均为100%的多重定量PCR，这种方法可检测E.histolytica、G.lamblia和C.parvum，而且还可推广至肠道寄生虫感染的常规诊断方法[29]。确切的诊断结果要求检测样品的处理和反应条件必须标准化，具有国内标准的多普勒或多重PCR方法解决了这个问题。目前针对临床样品进行E.moshkovskii检测的定量PCR尚未见报道，需要进一步研究。

尽管定量PCR能敏感到检测单个细胞，但一个反应中可应用的探针数量有限，因此影响了多目的基因的检测和基因分析[28]。当使用同一引物进行定量PCR扩增时，如一种样品的量过大可能会影响第二种样品的检测，仅通过使用不同探针来区分目的基因的多普勒或多重定量PCR不适合在一个反应中同时检测多种微生物，另外，定量PCR与粪便样品的显微镜检查和抗原检测相比，费用较高，因此，在E.histolytica流行的贫困地区，很少应用定量PCR进行检测，目前在发达国家的临床实验室中，定量PCR主要用来诊断高危人群的阿米巴痢疾，高危人群包括同性恋、旅游者和来自E.histolytica流行地区的入境者等。

2.3基因芯片技术 DNA芯片是用于病原检测的新技术，其结果快速、敏感，包括以下4个步骤：DNA提取、目的基因扩增、标记的DNA与固定在芯片上的寡核苷酸探针杂交和数据分析。近年来，寡核苷酸芯片已经成功应用于许多病原的诊断，它在临床和流行病学调查研究中对寄生虫的检测和鉴定具有重要作用。Wang等最早报道的寡核苷酸芯片是在同一反应中同时检测E.histolytica、E.dispar、G.lamblia集聚体A、B和C.parvum1型和2型，具有很高的特异性和敏感性[30]。除了区分主要基因型之外，这种方法在鉴定和区分E.moshkovskii和E.histolytica方面非常有效，但是，该研究选用的材料是从不同寄生虫的标准培养株中提取纯化的DNA[30]，因此，其实际应用价值尚需进一步研究。近来发展了一种采用E.histolytica(HM-1：IMSS)的DNA克隆进行的基于芯片的基因分型技术(比较基因组杂交技术)，这是首次对内阿米巴分离株的全基因组分析，结果显示，此技术能够区分E.histolytica和E.dispar、能鉴定有毒力虫株的保守基因，还能发现潜在的基因型-表型关系[31]。

芯片技术目前主要作为一种研究工具，很少应用于寄生虫检测和鉴别的临床诊断实验室。然而，随着芯片技术检测费用的降低，此技术可能排在寄生虫研究技术的前列。

3 基因分型方法

临床研究发现不同E.histolytica虫株的致病力存在一定差异，因此有必要对这些虫株进行分型鉴定，确定其是否存在差异，然而，到目前为止，虫株鉴定工具十分有限。同工酶分析提供了第一种标记，但现在已知的同工酶谱不固定，因此，很多已命名的酶谱已不可靠。对于内阿米巴原虫，目前主要是针对SREHP基因、株特异性基因(SSG)、连接tRNA基因的短串联重复和甲壳素基因等进行基因分型。

Clark和Diamond描述了E.histolytica的种内变异，根据来自世界不同地区的E.histolytica培养物的研究表明SREHP基因和株特异性基因(SSG)具有明显的多态性。编码免疫显性表面抗原的SREHP基因编码包括8和12氨基酸串联重复，通过粪便和肝脏样品中提取的DNA进行基于SREHP基因的巢式PCR研究结果发现，引起肠炎或肝脏疾病的E.histolytica株内存在明显的差异[18]，但这些发现后来遭到了Haghighi等反驳[32]。SSG作为非编码基因，包含了大小从8～16 bp的串联重复序列，根据E.histolytica株内的重复数量可用来鉴别虫株，由于某些虫株完全缺失该位点，所以，很难作为种内分型标记[33]。

使用连接tRNA基因的短串联重复对E.histolytica进行基因分型可有利于对基因型与感染结果之间的可能关系进行调查[34]。甲壳素基因[35]是编码一个退化的7-氨基酸序列串联重复的基因，将其作为一种标记物已经对不同地域的粪便样品中提取的DNA进行了进行E.dispar种群的研究，发现有不同虫株的存在[19]。

其他针对重复序列的分型方法包括用于检测种间和种内差异的微卫星分型法，微卫星是包含有像(CT)n这样简单基序的DNA片段，微卫星分型是利用特异性引物通过PCR扩增微卫星进行的。包含内部重复序列的两个微卫星位点，位点1-2和5-6，对于E.histolytica和E.dispar显示出了可变的多态性[36-37]，提示这两个位点可作为E.histolytica和E.dispar流行病学调查分子标记的潜在可能性。

指纹分析在E.moshkovskii分离株中显示出了相当大的遗传差异，有人应用EmR引物对E.moshkovskii样品进行多态性检测，该研究由于在引物结合部位显示出了序列的不同而获得了一些成功[9]。随着人粪便中检测到E.moshkovskii数量的日益增多，关于E.moshkovskii分型方面的进一步研究将有利于此种阿米巴原虫感染的流行病学调查研究。

4 小 结

由E.histolytica引起的阿米巴病是人和动物感染的最常见的寄生虫病之一，在过去20多年中，有关该寄生虫不同方面的研究为当前及今后的研究方向奠定了良好的基础，比如与其关系较密切的E.dispar和E.moshkovskii等之间的鉴别诊断、E.histolytica的重新定义、E.dispar的重新描述以及来自病人的E.moshkovkii的发现已经很大程度上改变了群落内不同内阿米巴种类的流行情况。根据上述诊断方法和基因分型方法的优缺点及其使用局限性和可行性，为准确鉴定和区分临床检验中的三种内阿米巴原虫，开发新的方便、易行、快捷、费用低、敏感性高的检测方法已迫在眉睫，这对于疾病的诊断及其患者的临床用药等方面均可起到积极的指导作用，另外，探索出更稳定可靠的基因分型方法，对于内阿米巴原虫的分子流行病学、发病机制和传播机制等方面的研究将起着至关重要的作用。

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