应用蛋白质指纹图谱技术快速鉴别诊断菌阴肺结核

王 琳,翁丽珍,陈晓红,黄明翔,李学玲,林剑东,郭志平,熊丽君,刘坦业

我国是全球22个结核病高负担和全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。目前每年新发生的结核病人约130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。2010年全国第5次结核病流行病学抽样调查结果表明，我国活动性肺结核患病率为459/10万，其中菌阴肺结核占活动性肺结核比例高达73.5%(963/1 310)[1]。值得重视的是，肺部感染性疾病(简称肺炎)也是最常见的一种呼吸系疾病，其中90%以上是社区获得性肺炎(CAP)。一些肺炎尤其是严重耐药性肺炎也已成为当今医学界关注的焦点。这两者的早期诊断、鉴别诊断却存在很高的难度。

菌阴肺结核与肺炎的影像学及临床特点极为相似，是否有典型肺部影像学的表现，是菌阴肺结核诊断能否成立的重要依据，对于数字成像(DR)胸片显示孤立病灶的患者临床诊断难度更大[2]。为此，部分肺炎、肺部肿瘤、肺结核患者，仅靠影像学、血清学检验、细菌学检测、结核菌蛋白衍化物(PPD)皮肤试验等技术难以获得早期鉴别诊断结果。

蛋白指纹图谱技术(proteomic fingerprinting, PFP)是近几年发展起来的实验室诊断新技术[3]。在对临床疾病检测时，抓住绝大多数疾病都有特异的蛋白生物标志的本质，从而进行疾病监测和识别。它具有高通量、高重复性及高灵敏度与特异度等特点, 国内外应用蛋白质组学技术于恶性肿瘤已取得很好的效果，但国内应用蛋白质组学技术于肺部疾病的诊断仅见少数报道。

本研究主要探讨菌阴肺结核与肺炎患者相关蛋白指纹图谱的特征性，选择两者之间具有统计学意义的蛋白峰建立诊断模型，指导临床早期诊断及治疗。

1 材料与方法

1.1选例标准

1.1.1选择根据中华人民共和国卫生行业标准(WS 196-2001)《结核病分类》诊断标准经临床诊断的菌阴肺结核患者(A组)60例，男性31例(51.7%)，女性29例(48.3%)，平均年龄45.8岁。

1.1.2根据《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》(中华医学会呼吸病学分会，2008)标准确诊为肺炎的患者(B组)60例，男性33例(55.0%),女性27例(45.0%)，平均年龄44.3岁。

以上病例均无其它并存病，非妊娠、哺乳期妇女，无精神病、癫痫、过敏性哮喘、肺部肿瘤病史。

1.1.3健康者(C组)60例，均为学生，经结核菌蛋白衍化物(PPD)试验皮肤反应直径≤10 mm，X线(CT)胸片无结核病变、无肺外结核病、无其它肺部疾病。年龄18～23岁，平均年龄20.8岁。

1.2血清蛋白指纹检测方法

1.2.1主要仪器及样品准备 选用美国 Ciphergen 公司产品Ciphergen ProteinChip System，CPCS，型号：PBS II/C型 蛋白指纹图谱仪。WCX蛋白磁珠(WCX Magnetic Beads)(湖州赛尔迪生物医药科技有限公司)。

血清样品准备：抽取各组患者及健康者清晨空腹前臂静脉全血2 mL，置于4 ℃冰箱中1～2 h，然后4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上层血清分装后，置-80 ℃冰箱内保存。

1.2.2步骤

1.2.2.1血清样品处理 取5 μL血清样品加10 μL裂解液混合孵育30 min后，加入185 μL缓冲液稀释。

1.2.2.2取磁珠50 μL加入200 μL-PCR Tube中，磁铁上孵育1 min，去除上清液；PCR Tube加入50 μL缓冲液洗脱5 min后，磁铁上孵育1 min，去除上清液；PCR Tube再次加入100 μL缓冲液洗脱5 min，PCR Tube磁铁上孵育1 min，PCR Tube加入100 μL处理好的血清样品。

1.2.2.3加入血清样品的PCR Tube置于室温孵育30 min，PCR Tube磁铁上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入100 μL缓冲液洗脱5 min，PCR Tube磁铁上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入10 μL洗提 缓冲液 洗脱5 min，PCR Tube磁铁上孵育1 min，取5 μL上清液移至另一PCR Tube中，PCR Tube加入5 μL SPA饱和溶液充分混匀，取1 μL混合溶液加样到Au/Steel芯片上风干。

1.2.3数据收集 待芯片干燥后，ProteinChip System Ⅱc质谱仪进行数据收集。用Ciphergen ProteinChip 3.0软件自动采集数据。

1.2.4统计学分析 应用Biomarker Pattern5.0软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据进行处理，所有测得的蛋白质图谱进行统一标准化。对所获的数据进行统计学分析，采用多峰分析法，寻找差异峰，以具有差异峰表达者，且表现为高表达或低表达判断为阳性，没有差异蛋白峰表达者判断为阴性。组间比较采用t检验，以P<0.01为差异有统计学意义。计算 (x、s、P值，建立诊断模型并评价其灵敏度，特异性，阳性与阴性预测值及总准确率。

2 结 果

2.1在分子量0～50 000 m/z内范围对所绘制的蛋白峰进行分析比较 120例菌阴肺结核与肺炎患者及60例健康者血清中，共获得367个蛋白峰，其中5个峰(1 028.49、4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75 m/z)在菌阴肺结核、肺炎、健康者之间表达有显著的差异性，具统计学意义(P<0.01)。其中1 028.49 m/z在肺炎病例中表现为高表达，在菌阴肺结核病例中表现为低表达；4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75 m/z在菌阴肺结核患者中表现为高表达，而在肺炎患者中表现为低表达。菌阴肺结核、肺炎与健康者之间差异峰均值、标准差见表1。

表1菌阴肺结核、肺炎和健康者有显著差异的5个蛋白峰

Tab.1Thefifthproteinpeaksthatweresignificantlydifferentbetweenpulmonarytuberculosis,pneumoniaandhealthyvolunteers

Protein peak (m/z)Bacteriological negative pulmonary tuberculosis(x±s )Pneumonia(x±s)Healthy volunteers(x±s)P value1 028.49-0.42±4.612.09±4.171.93±1.1004 796.563.94±4.191.943±3.301.01±1.6207 564.776.27±8.732.92±2.582.98±3.870.0088 048.0243.92±13.084.03±1.804.08±1.90011 526.755.17±2.480.36±0.620.34±0.820

2.2以5个蛋白峰(1 028.49、4 796.56、7 564.77、8 048.02、11 526.75 m/z)组成的模型鉴别诊断菌阴肺结核与肺炎的敏感性与特异性分别均为82.5%(52/63)，85.9%(49/57)；总有效率为84.2%(101/120)；阳性预测值86.7%(52/60)和阴性预测值为81.7%(49/60)。该诊断模型在判别肺炎、菌阴肺结核患者与健康者之间，总有效率达89.4%(161/180)，特异性为100%(60/60)灵敏度为84.2%(101/120)，阳性预测值100%(101/101)，阴性预测值75.9%(60/79)；菌阴肺结核与肺炎、健康者3组预测情况见表2；差异蛋白峰代表8 048.02、1 028.49 m/z，见图1。

表2 菌阴肺结核与肺炎、健康者之间预测情况

Note: Between pneumonia and healthy volunteersχ2=82.82,P<0.01; between bacteriological negative pulmonary tuberculosis and healthy volunteersχ2=91.76,P<0.01; between pneumonia and bacteriological negative pulmonary tuberculosisχ2=115.06,P<0.01.

3 讨 论

病原体诊断和针对性治疗是控制结核病流行的有效措施，也是降低肺炎病死率的关键。为此，如何快速鉴别肺结核、肺炎的诊断、施以针对性的有效治疗，便成为当务之急。

蛋白指纹图谱技术(PFP),是通过蛋白指纹图谱仪利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解析形成荷电离子，根据不同质荷比的离子在仪器场中飞行的时间长短不一，由此绘制出一张质谱图案。其阅读器的准确率为氢原子的十分之一，这表明蛋白指纹图谱仪使医院进入原子级别的诊断世纪。蛋白指纹图谱技术特点是，在对临床疾病检测时，抓住绝大多数疾病都有特异的生物标志的本质，从而进行疾病监测和识别，即可对生物标志做直接鉴定，故优于其他如ELSIA、免疫荧光试验等其它间接测定生物标志的方法。同时，由于有一套灵敏的监测系统来检测和识别这些微量生物标志，因而决定了它在临床检测中的敏感度和准确性。

蛋白指纹图谱技术应用在肺部炎症上最典型的例子是应用于SARS诊断。中国学者对早期病人血清进行蛋白质指纹图谱技术检测,发现病人在临床发病早期(1～7 d),即可检测出相关的特异蛋白,其敏感性为98.16%,特异性为94.16%[4]。

2006年Agranoff等首次研究了结核病人血清的蛋白指纹图谱，采用表面加强激光解吸-电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization tiom of flight mass spectrometry SELDI-TOF-MS)技术分析179份活动性结核病与170份非结核对照组血清蛋白质谱，检测具有潜在诊断价值的生物标记物，结果显示诊断结核病的灵敏度为93.5%，特异度为94.9%，并不受HIV的影响，而且SELDI-TOF-MS技术具有能够高能量分析大量样品的指纹图谱的优点，为蛋白质组学用于结核病的诊断提供了科学的依据[5]。

图1菌阴肺结核、肺炎和健康者的8048.02、1028.49m/z血清蛋白峰

Fig.1Proteinpeakedat8048.02and1028.49m/zamongbacteriologicalnegativepulmonarytuberculosis,pneumoniaandhealthyvolunteers

王琳等“蛋白质指纹图谱技术在肺结核、肺癌鉴别诊断中的应用研究”，发现有4种蛋白峰倾向于肺结核诊断[6]；翁丽珍等“肺结核蛋白指纹图谱诊断技术研究”通过建立诊断模型判别肺结核的特异性为100%，灵敏度为88.5%，有效率为92.3%[7]。

本研究按《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》(中华医学会呼吸病学分会，2008)标准，选择菌阴肺结核、肺炎、健康者3组人群，每组各60例，进行血清蛋白质指纹图谱检测，找出3组间的特异蛋白质生物标志及其差异性，为菌阴肺结核、肺炎的早期诊断提供快速、敏感、特异性强的科学诊断依据，也为肺炎蛋白指纹图谱库的建立提供重要资料。

蛋白指纹图谱技术可以在1h 内取得报告，使临床医生更早期鉴别诊断菌阴肺结核与肺炎，为争取尽早治疗，提高疗效赢得宝贵时间。我们认为，蛋白质指纹图谱技术具有方法简便、检测快速，标本用量少的优点，是筛选结核病特异性标志物的有效手段，可以弥补痰培养结核分支杆菌等检查费时长等不足，有望成为菌阴肺结核与肺炎的早期辅助诊断指标。

参考文献：

[1]Wang Y. Fifth national tuberculosis epidemiological sampling survey. Fifth national tuberculosis epidemiological sampling survey data compilation[M]. Beijing: Military Medical Science Press, 2011, 2. (in Chinese)

王宇.全国第五次结核病流行病学抽样调查报告资料汇编[M].北京：军事医学科学出版社，2011:2.

[2]Li HR, Liu W. Diagnostic value of multi-slice spiral CT(MSCT) for sputum smear- and culture-negative pulmonary tuberculosis with solitary node in DR X-ray[J]. Chin J Antituberculosis, 2011, 33(8): 505-508. (in Chinese)

黎惠如，刘文.多层螺旋CT对DR胸片显示孤立病灶菌阴肺结核的诊断价值[J].中国防痨杂志,2011,33(8)：505-508.

[3]Xu Y. Research advance of protein fingerprint technology in laboratory diagnosis and clinical medicine[J]. Basic Clin Med, 2007, 27(2): 134-142. (in Chinese)

许洋. 蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展[J].基础医学与临床，2007,27(2)：134-142.

[4]Kang XX, Xu Y, Wu XY, et al. Establish of the proteomic fingerprints for potential application to early diagnosis of severe Acute respiratory syndrome (SARS)[J]. Clin Chem, 2005, 51(1): 56-64.

[5]Agranoff D, Fernandez-Reyes D, Papadopoulos MC, et al. Identification of diagnostic markers for tuberculosis by proteomic fingerprinting of serum[J]. Lancet, 2006, 368(9540): 1012-1021. DOI: 10.1016/S0140-6736(06)69342-2

[6]Wang L, Weng LZ, Li XL, et al. Study on the application of proteomic fingerprinting in the differential diagnosis of tuberculosis and lung cancer[J]. Chin J Antituberculosis, 2011, 33(4): 209-213. (in Chinese)

王琳，翁丽珍，李学玲，等.蛋白质指纹图谱技术在肺结核、肺癌鉴别诊断中的应用研究[J].中国防痨杂志，2011,33(4 )：209-213.

[7]Weng LZ, Wang L, Li XL, et al. Identification of diagnosis markers for pulmonary tuberculosis by proteomic fingerprinting[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(11): 1048-1051. (in Chinese)

翁丽珍，王琳，李学玲，等. 肺结核蛋白指纹图谱诊断技术研究[J].中国人兽共患病学报，2010, 26(11)：1048-1051.