慢病毒载体介导的RNA干扰及其在T淋巴细胞的应用*

杜晶晶， 孙轶华

(哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150081)

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是普遍存在于生物体中的一种序列特异性的基因表达调控方式，它是由小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)介导的特异性降解mRNA的过程[1]。T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞，在移植物抗宿主病等疾病中起到重要作用，是基因治疗中常用的靶细胞。但在RNAi技术中，T淋巴细胞基因转导效率低而影响了其应用。因此，提高目的基因对T淋巴细胞的转导效率对于这类疾的基因治疗具有重要意义[2]。现将慢病毒载体介导的RNA干扰技术在T淋巴细胞研究中的方法和应用作一综述。

1 RNA干扰的载体

RNA干扰的应用主要包括：(1)siRNA的设计与制备；(2)siRNA的转导；(3)RNA干扰效能的检测。将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子，这样就能在体内表达所需的siRNA分子，这种方法的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默；直接转导合成的siRNA进入细胞内能够特异性抑制哺乳动物细胞内目的基因的表达，但siRNA进入细胞后容易被降解且RNAi效应持续时间短[3]。针对这些情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达，但是，质粒载体转染哺乳动物细胞的效率不如病毒载体，且不能转染非分裂相细胞。慢病毒载体是常用的病毒载体之一，它是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。其特点为免疫原性低， 能感染分裂相和非分裂相细胞，对于一些按常规方法难以转入甚至无法转入的细胞，如原代细胞、干细胞等未分化细胞，通过慢病毒介导的方法能够大大提高基因的转导效率。慢病毒载体介导的RNA干扰技术就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNA干扰特异性抑制同源基因表达的作用相结合，是实现哺乳动物细胞siRNA稳定表达的理想工具[4]。

2 慢病毒载体介导的RNA干扰的作用机制

慢病毒载体介导的RNA干扰的表达载体有两类：一类分别转录有义RNA和反义RNA，两条链在细胞内互补结合生成siRNA；另一类则转录短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)。其中，shRNA更加常用，其结构主要由慢病毒载体骨架和shRNA表达框组成。shRNA表达框主要包括：RNA聚合酶III(RNA polymerase III，Pol III)依赖的启动子、shRNA结构序列以及终止子。其中，shRNA结构序列由两段互补序列相向组成，两段序列之间有4～10个碱基的中间序列。慢病毒感染细胞后，将此shRNA表达框整合进宿主细胞基因组。shRNA在宿主细胞被转录后，两段互补序列碱基配对结合，中间序列则成为茎环结构。茎环结构可被Dicer酶识别并切除，产生的siRNA将执行RNA干扰[4]。

小RNA是一类新发现的长度为21～25个核苷酸的小分子RNA,它普遍存在于多细胞生物中，是调控RNA的重要分子,根据小RNA的结构和功能大概可分为3类：siRNA、微RNA(microRNAs, miRNAs)和其它小RNA[5]。它的体外制备方式主要有3种：化学合成、体外转录及用RNase III 或Dicer酶消化长片段双链RNA制备siRNA。化学合成法最为昂贵，适用于已经找到最有效的siRNA的前提下，需要大量siRNA进行研究时使用；体外转录法则用于筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs且经费不十分充裕时。虽然化学合成的siRNA可以不经过任何细胞修饰而直接并入RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)发挥作用，但是依赖Dicer酶产生的siRNA通常比之更有效[6]。shRNA从正义和反义的DNA序列转录之后产生长度为19～29的核苷酸片段，中间由一茎环序列分隔，组成发夹结构[7]。因此，shRNA的一个优势就是它的茎环式二级结构是依赖Dicer酶途径产生的siRNA[8]；另一个优势是从DNA结构的稳定表达，另外，长度较短的shRNA也最大限度减少了哺乳动物双链RNA依赖的蛋白激酶R(PKR)的潜在活化[9-10]，从而限制了广泛存在的脱靶效应。当然，shRNA也可能通过模拟miRNA从而引起广泛的脱靶效应[11]。

3 慢病毒载体介导的RNA干扰技术在干扰T淋巴细胞功能中的研究策略

慢病毒载体介导的RNA干扰技术在静息细胞或活化的难转染细胞均能实现基因的高效转移，包括沉默T淋巴细胞的相关基因表达[12]，尤其在CD4+T淋巴细胞，一些基因表达的沉默对于HIV-1复制具有明显抑制作用，因此，这种技术对于研究T淋巴细胞的一些潜在功能意义重大。该技术的基本应用过程包括：设计和克隆一个shRNA的慢病毒转移载体；三质粒共转染293T细胞并浓缩病毒获得高滴度的病毒颗粒；获得病毒稳定感染的细胞系[13]；验证在该细胞系中目的基因的沉默程度。然而，由于各种原因导致靶mRNA的不完全沉默以及实验控制的不严格对翻译水平的影响，慢病毒介导的RNA干扰技术在人类细胞基因功能分析中的应用在一定程度上受到限制，这些限制主要表现在后2步：能否成功获得稳定感染的细胞系和能否严格验证RNA干扰程度，以下将重点介绍与此相关的研究策略。

3.1提高慢病毒对T淋巴细胞的感染效率 采用浓缩好的慢病毒颗粒感染T淋巴细胞首先需要确定病毒感染细胞的最适比例，即感染复数(multiplicity of infection，MOI)。在采用慢病毒载体基因转导技术研究整合素对T淋巴细胞功能调节的相关分子通路时发现,通常MOI值为50时比较合适，同时规范贮存用于实验的慢病毒颗粒对确保高效感染至关重要，在解冻后感染前慢病毒应始终置于冰上，尽量避免反复冻融慢病毒以确保每次感染细胞时的慢病毒MOI值相差不大。 在使用浓缩好的慢病毒颗粒感染T淋巴细胞时需要提前活化靶细胞，可使用植物血凝素促进T淋巴细胞活化，并且在慢病毒感染细胞的过程中添加白细胞介素-2以维持T淋巴细胞的长期培养[14]。研究发现目前使用Amaxa公司的核转染技术感染静息T淋巴细胞，是一种有效的方式，但转入的基因表达时间短暂[14-15]。

Polybrene是为了促进慢病毒感染靶细胞而常用的一种试剂，它可以增强病毒和宿主间的疏水作用，从而增加感染率[16]。离心感染病毒法是慢病毒感染T淋巴细胞过程中的重要步骤，可以很大程度上增加悬浮细胞(如T淋巴细胞)的感染率[14]。但是，在研究HIV-1病毒时发现，离心介导的增强HIV-1病毒进入细胞不是通过增加细胞与病毒的接触概率而发挥作用，相反，该过程伴有离心介导的肌动蛋白和丝切蛋白活化，从而增强病毒绑定、进入、DNA整合和核转移。因此，当采用离心法提高慢病毒对靶细胞的感染率时应结合具体实验目的谨慎分析数据结果[17-18]。

3.2避免脱靶效应RNA干扰程度主要通过RT-PCR和Westernblotting在mRNA和蛋白水平检测，但由于二者都是RISC组分，故功能界限并不清晰，且在介导沉默机制上有重叠，因此，在蛋白水平和mRNA水平同时证明表达降低才是传统意义的RNA干扰。如果只是蛋白水平降低，这很可能只是microRNA相关的转录机制参与其中[19]。

由于非目标效应的存在，采取适当的控制措施对于获得准确的RNA干扰实验结果非常重要，一个共同的金标准是靶蛋白的再表达和沉默前表型获救[20]。Miest等[21]曾使用γ逆转录病毒载体(gamma-retroviralvectors,MLV)验证靶蛋白的再表达情况，Llano等则采用稳定的质粒转染技术同样达到了目的[22]。当需要siRNA较多时，这种控制尤其重要，甚至需要定量检测蛋白水平的改变，从而精确估计沉默的程度。另外，当设计了针对mRNA不同区域的多条siRNA，并且证明了它们具有相似的干扰效果时[23]，可以不需要验证靶蛋白的再表达，RNA干扰的结果已经足够令人信服。当然，如果是进行大规模的基因扫描时，控制手段必须更加简化[19]。

为了克服这些缺陷，有人建立了一种单一慢病毒载体，它能够在同一种细胞中兼顾消耗内源性基因表达和表达抗原标记的抗靶基因siRNA。在人类T淋巴细胞，沉默α肌动蛋白1(RNAi-depletedα-actinin-1)会抑制基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)的趋化性，但是，当同时在T淋巴细胞中表达抵抗RNAi-α-ACTN1(RNAi-resistantα-ACTN1 ，rr-α-ACTN1)时，SDF-1的趋化功能可以被挽救。通过GFP标记rr-α-ACTN1可以检测到rr-α-ACTN1的亚细胞定位，这一系统不仅提供了对于RNAi内部非目标效应的控制，同时也是潜在的快速分析基因结构功能和基因治疗的工具[24]。

4 慢病毒载体介导的RNA干扰技术在T淋巴细胞研究中的应用

现在越来越多的研究人员开始采用慢病毒载体介导的RNAi技术来研究生物体的基因表达。该技术可广泛应用到包括功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号转导通路分析、疾病治疗等。

4.1研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。

细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxicT-lymphocyteantigen4, CTLA4)基因是T淋巴细胞介导的免疫调节中的一种重要基因，它与许多自身免疫性疾病有关，尤其是Ⅰ型糖尿病。通过慢病毒转基因技术建立小鼠RNAi模型，研究CTLA4自然变异带来的影响时发现，不同于相应的基因敲除小鼠多器官自身免疫表型，CTLA4表达减少导致的自身免疫性疾病优先集中在胰腺，随后迅速发展为糖尿病。这揭示了一种潜藏于CTLA4基因缺乏小鼠的淋巴组织增生和多器官自身免疫的特异性，而且容易被忽略，因此慢病毒介导的shRNA与传统的基因敲除技术相比，更容易发现与CTLA4表达变异相关的人类疾病[25]。

4.2研究信号转导通路的新途径 联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号转导途径中不同基因的上，下游关系。在炎症和免疫反应过程中，整合素对T淋巴细胞的黏附和迁移发挥重要作用，为了解T淋巴细胞中整合素发挥作用的具体分子通路，Banerjee等[14]用到了慢病毒载体介导的基因转移技术，从而有效地研究各个方面整合素的功能，甚至执行全基因组RNA干扰扫描以全面寻找到T淋巴细胞整合素功能的调节者。

4.3开展基因治疗的新策略HIV-1的靶细胞有CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、星状细胞等，其中主要是CD4+T细胞，慢病毒介导的RNA干扰作为一种探索基因功能的有力工具，已广泛应用于抗艾滋病研究[26-27]。传统的抗艾滋病药物主要针对病毒酶发挥作用因而常受到抗药性的限制，最近发现可以采用艾滋病毒依赖因子，或病毒复制依赖的宿主蛋白为靶点研制药物。研究证实Tat-SF1作为一种艾滋病毒依赖因子存在于SupT细胞(在许多HIV患者血清中出现的源于CD4+T细胞系并与自身抗体反应的细胞)中，但是它并不是病毒复制最重要的辅助因子且受到抑制时会影响细胞生长，从而表明了检测HIV-1在持续抑制宿主防御因子表达的细胞中的复制动态及细胞毒性的重要性，继而使它有望作为艾滋病的潜在治疗靶点[28-29]。

许多组织移植需要组织相容性匹配的人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)以预防移植排斥、降低免疫抑制水平而维持移植物存活时间、减少移植物抗宿主病的风险，尤其是对于骨髓移植更加重要。然而，近期的研究表明利用基因转移和基因调控技术可能开辟HLA表达水平降低的移植工程。当采用慢病毒介导的shRNA沉默HLA一类及等位基因时可以实现HLA在人类细胞表面高效且剂量依赖性减少，并伴有对同种反应性细胞毒性T细胞的抵抗作用，同时避免主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)被非限制性杀死[30]。

5 总结

慢病毒介导的RNA干扰应用于基因治疗是该技术发展的一个大方向。尽管可以采取多种方式控制慢病毒载体转染过程及避免脱靶效应，但由于T淋巴细胞是一种免疫细胞且悬浮生长，这些条件都决定了它是一种难转染细胞。因此，提高目的基因对T淋巴细胞的转染效率至关重要，这也预示着距离该技术大规模临床应用还有很长的路要走。但是，随着慢病毒介导的RNA干扰机制的进一步揭示，RNA干扰技术在T淋巴细胞功能研究和临床治疗药物研究中的应用必将具有更广阔的前景。

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