剪接变异体的肿瘤靶向性研究进展

李燕妮 综述 姚 晖 审校

染色体上的基因数目基本上是确定的，然而蛋白质组研究发现，生物体内的蛋白质种类常远远大于已确定的基因所产生的数量。在生物体内存在一系列可能导致蛋白种类增加的途径，如不同的转录起始位点的使用、选择性剪接、mRNA前体的编辑和翻译后的蛋白修饰（如磷酸化、糖基化等）。许多肿瘤相关基因受选择性剪接的调节。剪接过程精确度的丧失或变化、特定剪接模式的转换可能在肿瘤演进中发生，并且可能是致癌的主要因素之一［1］。本文仅对选择性剪接所产生的剪接变异体在肿瘤靶向性方面的研究进行综述。

1 选择性剪接及其调控机制

选择性剪接是指通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。最终的蛋白产物会表现出不同甚至相互拮抗的功能和结构特性，或者在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同表型［2］。选择性剪接是人类蛋白质组多样性的重要原因之一［3］。

选择性剪接存在于至少70%的基因中，具有高度组织特异性和条件特异性［4］，其主要模式有外显子跳跃（exon skipping）、内含子保留（intron retention）、5'和3'剪切位点的选择（alternative 5'and 3'splicing）和外显子互斥（mutually exclusive exons）［5］。

多种剪接因子在剪接变异体的形成过程中发挥着重要作用。研究证实核不均一核糖核蛋白家族（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）是一组核内RNA结合蛋白，通过特异结构与pre-mRNA结合形成复合体，参与mRNA剪接［6］；富含丝氨酸/精氨酸蛋白家族（serine/arginine-rich proteins）为非小分子核RNA结合蛋白，可通过与外显子的剪接增强子结合促进剪接，从而提高原本较弱的剪接信号，改变剪接位点的选择［7］。

随着研究的深入，众多非典型剪接变异体逐渐为人类所发现。非典型剪接变异体与通常表达的剪接体有着显著功能差异，许多潜在差异如配体结合或对细胞周期调节［8］的影响都与肿瘤发生发展密切相关。目前研究多集中于原癌基因、抑癌基因及肿瘤侵袭和转移有关的基因。

2 肿瘤相关基因剪接变异体在肿瘤诊断与治疗中的作用

由于选择性剪接事件的普遍存在，当剪接变异体与肿瘤进展相关时，可作为分子标志物对肿瘤进行筛选、诊断和预后判断。有研究报道通过体外转录和翻译实验在人蛋白激酶C-zeta（PRKC-ζ）的3'发现一个新的剪接变异体序列PRKC-ζ-PrC，其在前列腺癌细胞系和组织中特异性表达，可作为前列腺癌的一个新的分子标志物［9］。锌指转录因子6（KLF6）的剪接变异体KLF6 SV2在肝癌组织和细胞系中表达明显增高，而野生型KLF6在肝癌组织中表达则低于癌旁正常组织，二者的差异性表达可用于肝癌的辅助诊断［10］。Grismayer等［11］研究证实尿激酶受体的剪接变异体uPAR-del4/5通过调节细胞外蛋白质降解来降低乳腺癌细胞间黏附和侵袭，从而影响该病的恶性潜能，因而可作为乳腺癌的分子标志物用于预后判断。

剪接变异体还能够为肿瘤治疗提供潜在靶点以及多样化的治疗途径。Tilli等［12］研究证实osteopontin-c广泛表达于卵巢恶性肿瘤、交界瘤组织标本以及卵巢癌细胞系OvCar-3中。其过表达能够促进细胞增殖、侵袭、转移、集落形成及肿瘤生长，而其他非肿瘤特异性osteopontin变异体则无上述活性。该研究表明在不影响全长osteopontin及其非肿瘤特异性变异体表达水平的情况下，靶向下调osteopontin-c的表达是可提供抑制肿瘤进展的一种新方法。Caspase-9a剪接变异体在前列腺癌细胞系PC3中能够促进癌细胞凋亡，有学者采用表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）协同顺铂来提高Caspase-9a剪接变异体在PC3中的表达，从而有效抑制了癌细胞的异常增生［13］。在非小细胞肺癌细胞系中，谷氨酰胺对于癌细胞的生长至关重要，谷氨酰胺酶1（GLS1）是谷氨酰胺代谢途径的关键酶，短暂敲除其剪接变异体GAC能够明显抑制肿瘤细胞的生长，提示其可作为肿瘤代谢治疗的潜在靶点［14］。

此外，由于剪接因子在剪接变异体形成过程中发挥着重要作用，肿瘤组织中也存在着众多剪接因子的表达异常。Gibb等［15］研究发现肺腺癌转移相关转录子1（MALAT1）在食管癌、卵巢癌等17种恶性肿瘤组织中表达上调；hnRNP A1在肝癌中过表达［16］，采用RNA干扰技术下调其表达能够抑制癌细胞的增殖和迁移；精氨酸/丝氨酸蛋白激酶1（SRPK1）在卵巢癌组织及细胞系中表达增高，体外实验降低其表达会降低细胞增殖率，减慢细胞周期进展［7］。剪接因子同样既可以作为肿瘤分子标志物，也可为肿瘤基因治疗提供有效靶点。

3 靶向剪接变异体的方法

应用实验设计的寡核苷酸与特异性靶向序列进行结合是目前修改mRNA前体剪接错误的主要方式［17］。通过反义寡核苷酸影响剪接因子的作用，诱导变异外显子的跳跃，从而进行剪接修饰已经被证实是一种有效的治疗方法［18］。外显子跳跃技术是一种新的基因治疗技术，已经被应用于肿瘤治疗。通过诱导选择性剪接变异体的转换，使Bcl-x、WT1从抗凋亡变异体转变为促凋亡变异体，可应用于乳腺癌和白血病的治疗［19-20］。

采用反义治疗修复肿瘤细胞系中细胞周期调节机制，成为抑制肿瘤发生发展以及提高肿瘤患者生存率的一种有效方法。Carrasco等［21］发现反义寡核苷酸LY2181308能够诱导凋亡并使细胞对化疗药物诱导的凋亡更加敏感。近期一项临床试验采用Survivin的反义抑制联合多西他奇作为前列腺癌的治疗方法，有效提高了患者生存率。针对肿瘤特异性剪接变异体的反义治疗，能够在不影响正常变异体的情况下消除肿瘤细胞中的错误变异体蛋白［22］。

反义治疗的另一项应用是剪接交换寡核苷酸，即利用抗凋亡Bcl-xL和促凋亡Bcl-xS的剪接变异体的拮抗效应。有学者通过靶向Bcl-x前体mRNA的第2外显子的5'剪接位点，降低了Bcl-xL的表达，增加了Bcl-xS的表达，从而诱导凋亡的发生并减轻体内肿瘤负荷［19］。然而，这种方法并不适用于所有剪接变异体，例如雄激素受体由于剪接变异体的多样性，及剪接反调节中存在的基因内重组和复制使特异性变异体表达的调节受到一定的局限［23］。

4 结论

识别肿瘤特异性剪接变异体是选择潜在新靶点的关键步骤。大规模的测序如肿瘤基因工程收集了大量肿瘤基因数据，能够提供具有典型剪接变异的潜在标记和治疗靶点［24］。许多变异体的表达模式一经确定，就可为研究者提供大量信息。肿瘤特异性剪接变异体的靶向消除既可以独立作为一种治疗途径，又能够改进现有治疗方法的疗效。尽管现行制度限制了临床试验不可能涵盖全部剪接变异体，而只能针对最广谱的选择性剪接模式中的潜在靶点，但随着对肿瘤进展过程中特异性剪接变异体作用的逐步了解，患者个体特异性表达模式在肿瘤治疗策略中的应用以及更具靶向性的肿瘤基因治疗有望进一步实现。

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