SRF在胃癌细胞中的表达及其意义*

左 静 刘 亮 赵 敏 左连富

SRF在胃癌细胞中的表达及其意义*

左 静①刘 亮②赵 敏②左连富②

目的：研究胃癌细胞中血清应答因子（serum response factor，SRF）的表达水平，探讨SRF的表达与胃癌发生、发展关系。方法：利用RNAi技术沉默胃癌SGC-7901细胞SRF基因，荧光显微镜检测转染效率，CCK-8法检测细胞增殖情况，Real-time PCR法检测SRF基因表达水平，Western blot法检测SRF蛋白表达水平，流式细胞术检测细胞周期。结果：RNAi技术沉默胃癌SGC-7901细胞SRF基因后SRF蛋白下调为空白对照组的40.1%，有显著性差异（P＜0.05）。与空白对照组及阴性对照组相比，siRNA转染组细胞增殖明显受抑制，抑制率为64.24%，周期阻滞于G0/G1期（P＜0.05）。结论：SRF在胃癌细胞中表达可促进胃癌细胞增殖，以此促进胃癌的发生、发展。SRF很可能是胃癌防治的一个重要靶点。

胃癌 血清应答因子 流式细胞术

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其预后差，严重威胁了人们健康。因此胃癌的早期诊断及治疗一直是胃肠道肿瘤防治的重点和热点问题。胃癌细胞中血清应答因子（serum response factor，SRF）是一个重要的转录因子，调控涉及细胞增殖、迁移、分化、血管发生和凋亡等多方面。最近研究［1-2］发现其在肝癌、大肠癌等组织中高表达，可能参与肿瘤发生及发展。本研究利用RNAi技术沉默胃癌SGC-7901细胞SRF基因，从而探讨SRF与胃癌发生及发展的关系，为临床上胃癌早期诊断和治疗提供靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试剂、仪器及细胞株：SRF（sc-335）抗体购自美国Santa Cruz公司；SABC免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德公司；siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司；RNAi-Mate转染试剂购自上海吉玛制药技术有限公司；Epics XLⅡ型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。SGC-7901胃癌细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的设计与转染 根据SRF的mRNA序列，由上海吉玛制药技术有限公司设计并制作相应的4条siRNA，各组基因序列见表1，常规细胞转染。空白对照组：未经转染（不加入siRNA和转染剂）。转染组：加入针对SRF的siRNA及转染剂siRNA-Mate。转染对照组：仅加入与转染组等剂量的转染剂siRNA-Mate。阴性对照组：加入针对阴性对照的siRNA及转染剂siRNA-Mate。

1.2.2 Real-time PCR法检测mRNA的含量 常规Trizol提取细胞RNA，按照M-MLV逆转录酶试剂盒说明书进行cDNA的合成，常规Real-time PCR法进行基因合成，GAPDH作为内参。以标本扩增的CT值和标准曲线得出各组所检目的基因SRF mRNA的相对拷贝数，将各检测基因与内参基因GAPDH相对拷贝数比较，对比值进行统计学处理，并计算沉默效率（沉默效率=1-实验组比值/空白对照组比值×100%）。

1.2.3 CCK-8法检测增殖情况 将常规培养的细胞株制成细胞悬液，加入96孔培养板中，1×104/孔，37℃培养箱中培养至次融合，同步化24 h，按照实验设计分组，10孔/组；依照前述方法转染siRNA，37℃培养箱中培养48 h，加入10 μL/孔CCK-8，37℃培养箱中培养3 h，用酶标仪测定450 nm吸光度值，并计算抑制率（抑制率=1-实验组OD值/空白对照组OD值×100%）。

1.2.4 Western blot法检测SRF蛋白的表达 取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，冷PBS洗涤2次，使用RIPA试剂常规方法提取细胞蛋白。常规Western blot法检测细胞中SRF蛋白的表达，β-actin为内参照。对条带进行扫描，经Image J v2.1.4.7图像分析软件测量条带的OD值，各组目的蛋白经内参平衡（目的蛋白OD值/内参蛋白OD值）后，采用与对照组的比值作为该蛋白的相对表达量。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 细胞转染48 h后，常规胰酶消化，PBS洗2次，制备单细胞悬液，调整细胞密度至1×106/mL。用70%酒精4℃固定过夜，离心弃上清，PBS漂洗3次。加入400 μL PI染液，避光染色30 min。流式细胞仪检测，MultiCycle软件分析细胞周期比例。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，各组间采用方差分析，进一步两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌SGC-7901细胞siRNA-SRF的转染效率

转染带荧光标记的siRNA经荧光显微镜观察，80%以上的细胞表达绿色荧光（图1），转染效率约80%。

2.2 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞mRNA表达的影响

Real-time PCR检测结果显示，对胃癌SGC-7901细胞株给予siRNA-SRF干扰后，4条siRNA均能下调SRF mRNA的表达，对照组siRNA-SRF-900、siRNA-SRF-901、siRNA-SRF-1107、siRNA-SRF-1649分别为56.4%、36.4%、25.0%、53.6%，相应的沉默效率分别为43.6%、63.6%、75.0%、46.3%，差异有统计学意义（F=66.042，P＜0.05）。转染对照组、阴性对照组表达水平分别为94.5%、93.7%，差异无统计学意义（P＞0.05），其中siRNA-SRF-1107基因沉默效率最高（75.0%）。因此选用siRNA-SRF-1107进行后续实验研究。

2.3 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞SRF蛋白表达的影响

Western blot检测显示（图2），予以siRNA-SRF-1107干扰后，转染组的SRF表达水平明显下调（40.1%），差异有统计学意义（F=142.735，P＜0.05）。而转染对照组和阴性对照组表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 同组别小干扰RNA基因序列Table 1 Gene sequences of siRNA in various experiment groups

图1 荧光显微镜检测siRNA-SRF转染效率Figure 1 Transfection efficiency detected by fluorescence microscope

图2 Western blot法检测SRF蛋白表达Figure 2 SRF expression measured by Western blot

2.4 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

转染48 h以后，空白对照组、转染组、阴性对照组和转染对照组的OD值分别为1.784±0.326、0.638±0.170、1.738±0.261和1.663±0.141。转染入siRNA-SRF-1107后，SGC-7901细胞株增殖明显受限，抑制率为64.24%，与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组和转染对照组与空白对照组比较，细胞增殖抑制率分别为2.58%和6.78%，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞周期的影响

转染48 h后，流式细胞仪检测空白对照组、转染组、阴性对照组和转染对照组细胞周期（表2，图3）。空白对照组、阴性对照组和转染对照组在G0/G1、S、G2/M期百分比方面差异无统计学意义（P＞0.05）。而转染siRNA-SRF-1107后，SGC-7901细胞株G0/G1期百分比明显增加（P＜0.05），提示其被阻滞于G0/G1期。

表2 siRNA-SRF对SGC-7901细胞周期影响 （±s，n=3）Table 2 Effect of siRNA-SRF on the cell cycle of SGC-7901 cells（±s，n=3）

表2 siRNA-SRF对SGC-7901细胞周期影响 （±s，n=3）Table 2 Effect of siRNA-SRF on the cell cycle of SGC-7901 cells（±s，n=3）

*：Compared with the blank control，P＜0.05

S G0/G1 41.13±6.27 56.35±1.38*41.71±4.56 47.9±6.56 5.729 44.72±0.60 23.90±1.94*43.73±1.41 43.24±2.97 80.883 G2/M 14.15±6.17 19.75±2.27 14.56±5.87 8.86±6.60 2.618 Groups Blank control siRNA-SRF-1107 Mock transfection Negative control F

图3 siRNA-SRF对SGC-7901细胞周期影响Figure 3 Effect of siRNA-SRF on cell cycle of SGC-7901 cells

3 讨论

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率及病死率高［3-5］。且早期诊断困难，缺乏合理评估预后和治疗效果的分子生物学指标，因此对胃癌发生、发展机制的研究，尤其是特异性分子生物学指标的寻找，一直是临床关注的热点和难点问题之一。

SRF属于MADS盒家族的转录因子［6］，最近研究发现其在肝癌、大肠癌、甲状腺癌等组织中高表达［7-9］，可能参与肿瘤的发生、发展及侵袭、转移。关于SRF与胃癌发生、发展关系的研究目前鲜见报道。本实验主要探讨SRF与胃癌发生及发展关系，为临床上胃癌的早期诊断及治疗提供靶点，采用RNAi技术沉默胃癌SGC-7901细胞株SRF基因，Western blot结果显示转染组SRF蛋白表达水平显著降低。应用针对SRF的siRNA能够显著下调胃癌SGC-7901细胞株中SRF mRNA和蛋白水平的表达。

作为转录因子，SRF在调控细胞分化和细胞周期进程方面发挥着重要作用。有研究［1-2，10］表明在肝癌细胞株，采用过表达技术上调SRF的表达，能够使细胞获得间质细胞表型，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。而使用RNAi技术沉默SRF则引起相反效应，细胞增殖受抑。有研究［11-14］表明SRF是促进细胞增殖的间接调控因子，而在不同类型或不同来源细胞中，SRF对增殖调控作用不尽相同，在心血管、骨骼肌和平滑肌来源细胞中SRF mRNA表达的上调多提示SRF具有促进分化和增殖的效应［15］。本研究选择沉默效果最高的siRNA-SRF-1107，有效下调SRF在胃癌SGC-7901细胞株mRNA和蛋白的表达水平。利用CCK-8法检测细胞增殖情况，发现转染组细胞增殖明显受抑，而阴性对照组和转染对照组对细胞增殖无影响，进一步提示设计的siRNA特异性和靶向性强，采用的脂质体转染法对细胞增殖无影响。同时使用流式细胞术检测细胞周期，发现转染组细胞被阻滞在G0/G1期，提示SRF可能调控SGC-7901细胞周期，与胃癌细胞增殖密切相关。

综上所述，SRF可以通过调控细胞周期从而促进胃癌发生及发展，采用RNAi技术沉默SRF基因能够使胃癌SGC-7901细胞产生周期阻滞作用，使细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖。本实验为胃癌早期诊断及治疗提供了新的靶点，对于胃癌早期诊断及治疗具有指导意义。

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（2013-08-27收稿）

（2013-10-29修回）

SRF expression and its biological significance in gastric carcinoma cells

Jing ZUO1,Liang LIU2,Min ZHAO2,Lianfu ZUO2

Lianfu ZUO;E-mail:zuolianfu4909@sina.com
1Department of Medical Oncology,2Section of FCM Analysis,Tumor Institute,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China.

Objective:This study aims to explore the relationship between serum response factor(SRF)expression level and gastric cancer progression by detecting SRF expression level in cancer cells.Methods:The SRF gene in SGC-7901 cells was silenced by RNA interference.Transfection efficiency was detected by fluorescence microscopy,cell proliferation by CCK 8 method,SRF gene and protein expression level by real-time polymerase chain reaction and Western blot,and cell cycle by flow cytometry.Results:Cell treatment with siRNA-SRF induced significant reduction in SRF mRNA levels.Western blot analysis showed that SRF protein decreased by 40.1%in the siRNA group compared with that in the control group(P＜0.05).Compared with the blank,negative,and mock transfection control groups,cell proliferation of the siRNA-SRF group decreased.The inhibition ratio reached 64.24%,as measured by the CCK-8 assay(P＜0.05).Treatment with siRNA could block SGC-7901 cell cycle at G0/G1phase(P＜0.05).Conclusion:SRF expression is closely associated with gastric carcinoma cell proliferation.SRF protein level detection can provide a certain reference value in evaluating malignant gastric carcinoma progression.SRF is possibly an important target for the prevention and control of gastric cancers.

gastric carcinoma,serum response factor,flow cytometry

10.3969/j.issn.1000-8179.20131423

①河北医科大学第四医院肿瘤内科（石家庄市050011）；②河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室

*本文课题受河北省普通高等学校强势特色学科肿瘤学建设经费项目（编号：冀教高[2005]52号）资助

左连富 zuolianfu4909@sina.com

This work was supported by a grant from the Hebei Provincial Program for Subjects with High Scholarship and Creative Research Potential([2005]No.52).

（本文编辑：邢颖）

左静 主治医师，博士在读，主要研究方向为食管癌、胃癌的基础与临床研究。

E-mail：wdh970916@163.com