丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

陈建明 童晓洁 陈 瑾

广州医科大学口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学重点实验室，广州 510140

丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

陈建明 童晓洁 陈 瑾

广州医科大学口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学重点实验室，广州 510140

目的 研究丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响。 方法 将人牙周膜成纤维细胞培养在含不同浓度的丹参酮ⅡA培养液中（实验组），同时设不含丹参酮ⅡA的空白对照组，24、48、72 h后，以CCK-8法检测细胞的增殖情况。 结果 在倒置显微镜下，实验组贴壁人牙周膜成纤维细胞数目明显减少。加药培养48、72 h，不同浓度丹参酮ⅡA组细胞的光密度（OD）值明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。 结论 丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖有一定的抑制作用。

丹参酮ⅡA；人牙周膜成纤维细胞；牙周组织；改建

在口腔正畸治疗过程中，要把牙齿重新排列，需要对牙槽骨不断进行改建，而这个缓慢的过程有赖于成骨与破骨之间平衡的保持，涉及具有吸收骨质的破骨细胞、具有成骨功能的成骨细胞和牙周膜成纤维细胞复杂而紧密的偶联反应。怎样才能加快牙齿移动速度、缩短保持时间一直是国内外学者探索的课题。有学者研究发现，丹参酮ⅡA对破骨细胞有抑制作用[1]。而许多细胞因子通过作用于成骨细胞，从而间接地调节破骨细胞的分化成熟。由于牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征[2]，猜想丹参酮ⅡA可能会对牙周膜成纤维细胞产生抑制作用。本研究旨在探讨丹参酮ⅡA对牙周膜成纤维细胞增殖的影响，以期为临床牙周组织改建提供新的思路和方法。

1材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

α-MEM 培养基、胎牛血清（Gibco，USA）、丹参酮ⅡA（Sigma，USA），CCK-8 试剂盒（南京凯基公司）、倒置相差显微镜（Olympus，日本）、酶标仪（Thermo，USA）、恒温 CO2培养箱（Thermo，USA）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人牙周膜取自正畸牙的患者，患者年龄12～29岁，刮取牙根中1/3牙周膜，均匀铺于6孔板内，加入含15%胎牛血清的α-MEM培养液，饱和湿度、5%CO2、95%空气，37℃（标准环境）孵育，每 3～5天换一次液，直至细胞从组织块游离出并长满。当原代人牙周膜成纤维细胞约80%融合时，再以1∶3或1∶4传代。将第5代细胞用于实验。

1.2.2 实验分组与处理 取对数生长期人牙周膜成纤维细胞制成2×108/L细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，培养 24 h 后，分别更换为 20、40、60 μg/ml丹参酮ⅡA的α-MEM培养液（每孔100 μl），每组设4个复孔，同时设不含丹参酮ⅡA的空白对照组。继续培养24、48、72 h后，在相差显微镜下观察各组的细胞形态。

1.2.3 CCK-8法检测丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖活性的影响 继续培养24、48、72 h后，向各孔中加入10 μl新型细胞增殖及毒性检测溶液。37℃下孵育2 h，酶标仪在450 nm波长处检测每孔的光密度（OD）值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，不同时间段采用单因素ANOVA检验及多样本均数间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度丹参酮ⅡA对牙周膜成纤维细胞的形态学观察

不同浓度的丹参酮ⅡA作用人牙周膜成纤维细胞24 h后，对照组细胞基本贴壁，细胞形态呈梭型；实验组细胞仅存少量的贴壁细胞。培养48 h后，对照组牙周膜成纤维细胞基本长满培养孔底；20 μg/ml组中，贴壁细胞较24 h前增多，细胞呈梭形；40 μg/ml组与60 μg/ml组培养孔中，仅见少量的贴壁细胞，细胞形态呈不规则形。培养72 h后，对照组牙周膜成纤维细胞完全长满培养孔底；20 μg/ml组与 40 μg/ml组中，贴壁细胞较少，细胞形态多样；60 μg/ml组培养孔中，仅见少许的贴壁细胞（图1）。

图1 人牙周膜成纤维细胞在不同浓度丹参酮ⅡA中培养24、48、72 h 后的形态

2.2 不同浓度丹参酮ⅡA对牙周膜成纤维细胞增殖活性影响的OD值

加丹参酮ⅡA培养24 h后，不同浓度组的OD值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。加丹参酮ⅡA培养48、72 h后，不同浓度组的OD值与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.001）；各浓度组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1、图 2）。

表1 不同浓度丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖活性影响的OD 值（±s）

表1 不同浓度丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖活性影响的OD 值（±s）

与对照组比较，*P<0.001

组别 24 h 48 h 72 h对照组20 μg/ml组40 μg/ml组60 μg/ml组0.560±.0740 0.540±0.230 0.506±0.065 0.509±0.031 0.610±0.038 0.376±0.031*0.376±0.032*0.357±0.020*0.586±0.045 0.303±0.130*0.289±0.045*0.320±0.075*

图2 不同浓度丹参酮ⅡA对人牙周膜成纤维细胞增殖活性的影响与对照组比较，*P<0.001

3 讨论

牙周膜细胞是一组有异质性的细胞群，包括了成牙骨质细胞、成骨细胞和牙周膜成纤维细胞等，其中成骨细胞和牙周膜成纤维细胞是牙周组织中的两种重要的细胞成分，它们与破骨细胞一起参与牙周骨质平衡的维持，对于稳定正常牙周膜的生理功能起关键作用。

Kwak等[3]研究发现，丹参酮ⅡA通过调控成骨细胞上的NF-κB的配体和骨保护素来调节破骨细胞的活性。研究还发现，丹参酮ⅡA对破骨细胞分化的抑制作用是丹参酮ⅡA通过作用于成骨细胞，抑制其前列腺素E2/环氧化酶-2信号途径而实现的。

研究表明，牙周膜成纤维细胞与成骨细胞具有相似之处，牙周膜成纤维细胞有向成骨细胞分化的趋势，在一定情况下，可以表现出成骨细胞的特征[4-5]。Kanzaki等[6]将末梢血单核细胞与牙周膜成纤维细胞进行直接或间接共培养4周，直接共培养体系中牙本质片上形成较多的骨吸收陷窝，同时发现牙周膜成纤维细胞可以表达核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）。张丁等[7]也在人牙周膜细胞胞膜和胞质上发现RANKL蛋白的表达，同时在培养液中检测到OPG蛋白，说明牙周膜成纤维细胞可能会像成骨细胞一样，也可以参与破骨细胞的调节。

近来，有学者发现丹参酮ⅡA也参与牙周组织改建。张晓燕等[8]发现，丹参酮能促进牙槽骨骨形成和抑制骨吸收，防治牙槽骨骨质疏松。进一步说明，丹参酮ⅡA、破骨细胞、牙周膜成纤维细胞间存在密切的联系。本实验结果显示牙周膜成纤维细胞在丹参酮ⅡA作用48、72 h后，其增殖受到了明显的抑制，其中以40 μg/ml组最为明显。先前笔者研究发现，末梢血单个核细胞作为破骨细胞的前体细胞，只有在牙周膜成纤维细胞存在的条件下，才能形成多核的破骨样细胞，其单独存在无法形成破骨细胞[9]。因此，猜测丹参酮ⅡA有可能通过抑制牙周膜成纤维细胞，间接产生抑制破骨细胞的作用，但是，其具体机制有待进一步研究。

[1]Kim HH，Kim JH，Kwak HB，et al.Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by tanshinoneⅡA isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge[J].Biochem Pharmacol，2004，67（9）：1647-1656.

[2]骆凯，闫福华，金岩，等.体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测[J].口腔医学，2004，24（1）：8-10.

[3]Kwak HB，Sun HM，Ha H，et al.Tanshinone ⅡA suppresses inflammatory bone loss by inhibiting the synthesis of prostaglandin E2in osteoblasts[J].Eur J Pharmacol，2008，601（1-3）：30-37.

[4]Liang L，Yu JF，Wang Y，et al.Effect of estrogen receptor beta on the osteoblastic differentiation function of human periodontal ligament cells[J].Arch Oral Biol，2008，53（6）：553-557.

[5]Dereka XE，Markopoulou CE，Mamalis A，et al.Effect of rhBMP-7 combined with two bone grafts on human periodontal ligament cell differentiation[J].Growth Factors，2009，27（5）：274-279.

[6]Kanzaki H，Chiba M，Shimizu Y，et al.Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition[J].J Dent Res，2001，80（3）：887-891.

[7]张丁，杨雁琪，李小彤，等.人牙周膜细胞骨保护因子和破骨细胞分化因子蛋白的表达及1α，25（OH）2维生素D3的调节[J].北京大学学报（医学版），2004，36（6）：646-649.

[8]张晓燕，崔燎，吴铁，等.丹参酮对去卵巢大鼠牙槽骨丢失的抑制作用[J].中国老年学杂志，2012，32（1）：113-114.

[9]陈建明，兰泽栋，刘嵘.牙周膜成纤维细胞对外周血单个核细胞分化的影响[J].口腔医学研究，2011，27（9）：808-811.

The effect of tanshinoneⅡA on proliferation of human periodontal ligament fibroblasts

CHEN Jian-ming TONG Xiao-jie CHEN Jin
Stomatology of Guangzhou Medical University;Stomatology Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University;Key Laboratory of Oral Medicine,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510140,China

ObjectiveTo study the effect of tanshinoneⅡA on proliferation of human periodontal ligament fibroblasts.Methods Human periodontal ligament fibroblasts was cultured in different concentrations of tanshinoneⅡA suspension in vitro (experimental group),control group without tanshinoneⅡA was selected.After 24 h,48 h,72 h,cell proliferation ability was examined by CCK-8.ResultsLess adherent cells were found in experimental groups under an inverted microscope.Meanwhile,after 48 and 72 hours culture,the OD values of experimental groups was lower than that of control group,had significant difference(P<0.001).ConclusionTanshinoneⅡA may inhibit the proliferation of human periodontal ligament fibroblasts.

TanshinoneⅡA;Human periodontal ligament fibroblasts;Periodontal tissue;Remodeling

R780.2

A

1674-4721（2014）04（c）-0021-03

广东省中医药局资助项目（20121129）

陈建明（1982-），男，汉族，福建人，硕士，主治医师，主要从事口腔正畸学基础与临床研究

2014-03-12 本文编辑：郭静娟）