金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

项 云，屠平光，章啸君，楼芳芳，杜喜忠，胡旭进

(金华市农业科学研究院畜牧所，浙江 金华321000)

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术，成纤维细胞具有易培养，增殖快，形态和遗传性能稳定，可长期、完整、大量地保存生物体遗传信息的特点［1］。因此，通过构建家畜品种成纤维细胞库的途径保存或拯救其种质资源是目前最为理想的方法之一［2］。1997年，Wilmut 等用体细胞核移植转基因法获得世界上首例转基因克隆绵羊。转基因动物克隆以体细胞核移植技术作为基础，目前体细胞克隆转基因牛(Cibelli，1998)，山羊(Baguisi，1999)，猪(Polejaeva，2000;Lai，2002年)等相继获得成功［3］。而成纤维细胞是核移植中的一种理想供体细胞。

金华猪作为中国优良的地方猪种之一，在育种方面具有巨大的潜力。本试验研究了金华猪耳缘组织成纤维细胞的分离与原代、传代培养及生物学特性，获得了能在体外正常传代培养的细胞系，为动物克隆、转基因动物及其他细胞生物学研究提供细胞资源。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 DMEM(Dulbecco's Modium Essential Medium)培养液;胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS);青霉素、链霉素混合液(含青霉素10000 U/mL、链霉素10 μg/mL);0.25%胰蛋白酶溶液;PBS 液等均为Hyclone 公司产品。Giemsa 染液(Giemsa stain)为Fluka 公司产品;完全培养液:含100U/ml 青霉素钠、100ug/ml 硫酸链霉素、10%FBS的DMEM 培养液;冻存液:含10%DMSO 和20%FBS 的DMEM 培养液;液氮罐YDS-30;倒置显微镜OLYMPASCKX41;二氧化碳培养箱Thermo311 型;超低温冰箱Thermo702 型。

1.2 试验方法

1.2.1 取材及处理 活体采集3 ～5日龄金华猪耳缘皮肤组织，用75%酒精充分清洗消毒，无菌条件下剪取大小为0.5 cm×0.5 cm 耳部皮肤，置于含双抗的PBS 液中，反复漂洗3 ～5 次，直到漂洗液清亮透明为止，吸去PBS 液，加入中性蛋白酶10 mL，4℃消化过夜，用眼科镊细心分离皮肤表层与真皮层，剪成0.5 ～1 mm3大小的组织块;用吸管将组织块转移至50 mL 离心管内，注入新鲜含双抗的PBS 溶液，重复洗涤3 次，弃最后1 次洗涤液，取沉淀组织备用。

1.2.2 组织块贴壁培养法 向离心管内加入37℃预温、含有10%胎牛血清的DMEM 培养液2 mL，用无菌吸管将组织块转移至专用培养瓶中(均匀铺开，间距5 mm 左右)，吸去多余培养液，倒置培养瓶，加培养液3 mL，放入37℃、5% C02培养箱中4 h，待组织块充分吸附于培养瓶底部后，轻轻翻转培养瓶，慢慢加入37℃预温培养液5 mL，重新置于5%CO2浓度的培养箱中进行原代培养，48 h 后观察细胞生长和污染情况，及时换液，72 h 后观察细胞生长情况。

1.2.3 原代细胞的分离与传代 将细胞培养液从细胞板中吸出，用DPBS 液清洗贴壁细胞，清除残留的DMEM 细胞培养液和坏死脱落细胞，加入500 μL胰酶消化3 min。显微镜观察细胞形态变化，待细胞变圆时，立即加入800 μL DMEM 液终止酶消化，离心(1000 r/min)，弃上清液，加DMEM 液，按1∶4比例，分别接种于四孔板中，传代完成。

1.2.4 耳缘成纤维细胞的冷冻与复苏 根据上述方法消化细胞，1000 r/min 离心后，弃上清液，加入4℃预冷的冷冻液1 mL，4℃保存0.5 h，－20℃保存2 h，放入－80℃过夜保存，第2 d 移入液氮中保存。复苏时，从液氮中取出，放入37.5℃恒温水浴锅中1 min，加入DMEM 培养液清洗细胞2 次，然后加入细胞培养液，放入培养箱中培养。

1.3 细胞活力测定 将冻存前及复苏后的传代细胞制成细胞悬液，取0.5 mL 放入小离心管中，加入0.02 g/mL 的Trypan blue 染液0.1 mL 混合，2 min后用血球计数板显微镜下直接测定细胞存活率。

1.4 细胞形态观察(Giemsa 染色法) 将灭菌盖玻片放入一次性细胞培养皿中，将适量真皮成纤维细胞悬液加入培养皿中，置于5% CO2培养箱中培养。待真皮成纤维细胞在盖玻片上长成良好单层后，取出玻片浸入无水甲醇中固定15 min，然后用新无水甲醇冲洗，随后放入纯Giemsa 染液中染色10 min。从Giemsa 染液中取出玻片经干燥和二甲苯透明。最后中性树脂封片，显微镜下观察细胞类型、性状、大小、核质比例、染色质和核仁大小及生长状态。

1.5 细胞生长曲线 采集生长良好的真皮成纤维细胞，采用细胞传代方法制成细胞悬液。经计数后，将密度为2.53 ×104/mL 细胞悬液接种于24 孔细胞培养板中，每孔1 mL。每隔24 h 取出3 孔细胞分别进行细胞计数，求平均数，连续计数8 d，以培养时间为横轴，每日细胞数平均值为纵轴，作曲线图，即得到体外培养真皮成纤维细胞的生长曲线。

1.6 数据分析 对细胞冻存前后的存活率进行t检验，用SPSS 进行χ2检验。

2 结果与分析

2.1 成纤维细胞形态学观察 经原代组织块贴壁法培养耳缘组织成纤维细胞，4 d 即可见到真皮组织块边缘向外游离生长出单个细胞，细胞呈圆形，随后伸展梭形、多边形。培养7 d 即可明显看到大量细胞向外植块边缘生长。随细胞游离出来的细胞增多，生长速率逐渐加快，15 d 后，细胞基本布满培养瓶。倒置显微镜下观察，可见细胞以梭形和多角形为主，细胞饱满，胞核成卵圆形，细胞向四周呈放射状生长，形成致密单层细胞。细胞经胰酶消化后形状变圆。经过2 ～3 次消化传代后即可获得纯化的成纤维细胞。

2.2 成纤维细胞Giemsa 染色 高倍镜下观察，细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处有椭圆形细胞核，可见2 ～4 个核仁，细胞轮廓清晰，伸展良好，细胞排列紧密规则。采用Giemsa 染色，细胞质与细胞核具有明显的颜色对比性，能清晰显示出细胞形态及分裂的不同时相，能有效判断细胞的生长状态与健康状况。

2.3 传代培养耳缘组织成纤维细胞的生长特性传代培养的成纤维细胞与原代细胞其形态及生长速度均无明显差异，细胞质生长与分裂依然十分旺盛。单层细胞传代4 d 后便可重新长成单层细胞，对0.25%胰蛋白酶消化的敏感性比原代培养细胞明显增强。从体外培养的耳缘真皮成纤维细胞对数生长曲线可看出，细胞生长前24 h 为迟缓期，第2 ～4 d为生长期，第6 d 后进入平稳期。

2.4 成纤维细胞的冷冻保存与复苏结果 利用改良血球计数板测定细胞冻存前24 h 及细胞复苏后24 h 的平均存活率与贴壁率。统计结果表明，金华猪耳缘组织成纤维细胞冻存前和复苏后平均存活率分别为95.6%和93.8%，细胞复苏24 h 后，85%以上细胞贴壁于培养瓶底生长。由此可见，冻存和复苏后传代细胞活力影响较小，细胞生长状态良好。

3 小结与讨论

在动物细胞原代培养发展的过程中，动物原代细胞培养主要分为2 种方法，组织块贴壁培养法和酶消化法。本试验采用组织块培养法获得金华猪耳缘成纤维细胞，该方法简单有效，获得的成纤维细胞可以在体外至少传代10 代。前期虽有少量上皮细胞存在，但根据不同类型细胞对胰酶的敏感度不同进行纯化，培养2 ～3 代后即可获得较纯的成纤维细胞［4］。传代细胞在培养过程中细胞形态典型，呈现出“S”型生长曲线，表明细胞生长正常。

本试验材料采自仔猪耳缘皮肤组织，仔猪皮肤组织修复能力较强，伤口很快愈合，不影响供体动物健康，且还可进行再次取样。因此，新生猪成纤维细胞的取材方式比胎儿成纤维细胞方便，更适合于珍稀物种与濒危动物的细胞培养与核移植胚胎提供核供体。细胞培养中需要的培养液、血清及其他营养物质，不同生产厂家、产品批号、对细胞培养有一定影响［5］。

本试验采用Hyclone 公司生产的高糖DMEM 培养液，血清含量为15%的培养基进行原代培养，传代后改在培养基中添加10%的血清进行培养。结果表明，DMEM 培养的金华猪耳缘组织成纤维细胞优先从组织块中移出，细胞生长状态良好，与张小建等(2007)［6］研究结果基本一致。

哺乳动物细胞冷冻保存方法中，普遍采用DMSO 作为冷冻保护剂。选择冷冻剂及冷冻方法一般着重考虑是否有利于细胞在最短时间内脱水，减少细胞内大冰晶的形成［7］。

本试验采用10%DMSO +20%FBS DMEM 培养液作为细胞冷冻液，4℃、－20℃、－80℃平衡后直接投入液氮中保存。细胞冻存前与复苏后的存活率无显著差异。

动物细胞培养技术现已成为一项比较成熟的技术，该技术在生物学研究中具有广阔前景。本试验成功建立了金华猪耳缘组织成纤维细胞系，该细胞系的建立，使金华猪这一重要物种资源在细胞水平上得以保存，为后期核移植和转基因的研究提供了基础材料。

［1］卢桂强，李海华.我国地方家禽遗传种质资源保存的研究概况［J］.上海畜牧，2005，5:52－54.

［2］关伟军，马月辉.频危畜禽品种细胞库的构建与鉴定［J］.中国农业科技导报，2003，5:5－8.

［3］周向梅，马月辉，关伟军，等.云南矮马耳缘成纤维细胞系的建立及其生物学特性［J］.动物学报，2004，50(5):863－868.

［4］Yang X，Jiang S，Farrell D，et al.Nuclear transfer in cattle:effect of nuclear donor cells cytoplast age to culture and embryo transfer［J］.Mol ReProd Dev，1993，35(1):29－36.

［5］斯佩科特D I..细胞实验指南［M］.黄培堂，译.北京:科学出版社，2001.

［6］张小建，李键.张兴友.牦牛成纤维细胞的体外培养研究［J］.湖北农业科学，2007，46(3);344－347.

［7］任芳丽，李煜，张涌.牛成纤维细胞体外培养与冻存［J］.黄牛杂志，2002，28(1):8－10.