鹅膏菌肽类毒素的研究进展*

赵春艳，王婷婷，邰丽梅，侯 波，冯云利，刘 蓓

(中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221)

我国毒菌资源十分丰富，约有500种，已经报道有400多种[1－4]，每年因误食毒菌中毒死亡事件在世界各地频发。在欧洲，95%死亡由鹅膏属一些种类所致，鹅膏属 (Amanita)属于真菌门、担子菌亚门、担子菌纲、伞菌目、鹅膏菌科，是一类外生菌根菌，常和松、柏共生，多数种是著名的肝脏损害型毒菌[5，6]。据报道，2000年3月广州发生致命鹅膏中毒事件，9人中毒，8人死亡，毒菌事件发生后，广州野生食用菌菌市场受到很大影响[7，8]。在我国鹅膏菌种类繁多，含亚种、变种和变型，已记载100种，常见剧毒鹅膏菌主要有致命鹅膏 (A.exitialis)、黄盖鹅膏白色变种 (A.subjunquillea var.alba)和灰花纹鹅膏 (A.fuliginea)[9]。鹅膏属、环柄菇属(Lepiota)及盔孢伞属 (Galerina)中的一些种类富含鹅膏肽类毒素，其中，鹅膏属主要有 A.phalloides、A.bisporigera、A.virosa、A.ocreata、A.bygroscopia、A.suballi-acea、A.verna、A.tenuifolia等;环柄菇属中主要是Lepiota helveola、L.brunneoincarnata、L.castanae、L.josserandi、L.heteri、L.scobinella 等;盔孢伞属中含有鹅膏肽类毒素的主要是Galerina marginata、G.unicolor、G.venenata、G.beinthii、G.autumnalis 等[10]。鹅膏肽类毒素少数可以从菌丝培养物中获得，但鹅膏属大多为外生菌根菌，不易人工培养，其肽类毒素主要从野外子实体分离获得[11]。

1 鹅膏肽类毒素种类

经鉴定的鹅膏菌毒素大约有22种，最主要为鹅膏毒肽(Amatoxins)、鬼笔毒肽 (Phallotoxins)、毒伞素 (Virotoxins)、毒蝇碱 (Muscarine)、鹅膏氨酸 (Ibotenic acid)、异恶唑 (Isoxazole)衍生物以及Muscimol、Coprine等;按照氨基酸组成和结构可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽、毒伞素，此3类毒肽都是环化小分子，统称鹅膏肽类毒素，其化学性质稳定，耐高温、酸碱、冷藏，易溶于水、酒精，一般烹调不能使其分子破坏，饮食蕈汤也可中毒。

1.1 鹅膏毒肽

鹅膏毒肽又称毒伞肽，为双环八肽 (缩八氨酸)碳架。天然的鹅膏毒肽包括α－鹅膏毒肽 (α－amanitin)、β－鹅膏毒肽 (βamanitin)、γ－鹅膏毒肽(γ－amanitin)、ε－鹅膏毒肽(εamanitin)、三羟鹅膏毒肽 (Amanin)、三羟鹅膏毒肽酰胺 (Amaninamide)、二羟鹅膏毒肽酰胺 (Amanullin)、二羟鹅膏毒肽羧酸(Amanullinic acid)和二羟鹅膏毒肽酰胺原 (Proamanullin)9种，A.suballiacea、A.verna、A.ocreata、A.bisporigera、A.virosa 等鹅膏菌都含有此肽，其最初从欧洲毒鹅膏A.phalloides中分离得到，α－amanitin和β－amanitin为最主要致死毒素，鹅膏毒肽毒性与化学结构密切，有无S=O键、环肽结构及整体空间结构变化都会影响其毒性[12－14]。

1.2 鬼笔毒肽

鬼笔毒肽又称毒肽，是环状七肽碳架结构，最初从A.phalloides中分离得到，二羟鬼笔毒肽 (Phallicidin)和二羟鬼笔毒肽 (Phalloidin)是其主要的毒素，其它还包括三羟鬼笔毒肽 (Phallisin)、羧基一羟鬼笔毒肽 (Phallisacin)、羧基二羟鬼笔毒肽 (Phallacidin)、羟基三羟鬼笔毒肽 (Phallsacin)和一羟鬼笔毒肽原 (Prophalloin)等毒肽[15]。

1.3 毒伞肽

毒伞肽为单环七肽，最先从鳞柄白毒鹅膏分离到，目前已有6种天然毒伞肽类毒素被鉴定分离:Alaviroidin、Aladesoxoviroidin、Viroisin、Desoxoviroidin、Desoxoviroisin、Viroidin[16]。

2 鹅膏菌肽类毒素作用机理、毒性及中毒症状

2.1 鹅膏菌肽类毒素作用机理

鹅膏毒素在细胞内的毒性作用机理是通过抑制细胞内的转录和翻译导致细胞坏死，患者主要表现为急性肝坏死而导致死亡率极高。α－Amanitin能够专一抑制真核细胞RNA聚合酶的合成，阻止信使RNA延长，诱导细胞凋亡。早在1965年Fiume等[17]采用电镜观察α－Amanitin中毒小鼠的细胞核变化，发现核裂解，核染色质固缩，并利用这种毒肽进行细胞核形态学的研究。Dangarard等[18]用 α－Amanitin处理中国大白鼠卵巢细胞后观察到同样的现象。因此研究提出α－Amanitin中毒的小鼠除出现肝细胞坏死现象外，可能存在另1种机制即肝细胞凋亡[19]。近些年，研究者们对鹅膏肽类毒素诱导细胞凋亡作了大量的研究，Karlson[20]、刘建强[21]等对小白鼠腹腔注射鹅膏菌毒素，用琼脂糖凝胶电泳观察时发现注毒小鼠肝细胞出现了DNA梯形凋亡特征带，对照却无此带。徐璐研究表明 α－Amanitin对小鼠皮肤癌、肝癌细胞 SMMC－7721和H22荷瘤小鼠抑制效果较好[22]，且 α－Amanitin能够抑制乙型肝炎病毒复制过程[23]。Stirpe和 Fiume等发现 α－Amanitin中毒最初24 h内，小白鼠肝细胞核RNA含量下降，此表明经α－Amanitin处理的小白鼠肝细胞核RNA合成受阻，即RNA聚合酶活性受到抑制[24，25]，但不同生物及类型的RNA聚合酶对鹅膏毒肽的敏感性具有很大差异。研究发现鹅膏毒肽与RNA聚合酶Ⅱ间相互作用优先发生在鹅膏毒肽分子一侧[26]，其除了与RNA聚合酶Ⅱ结合外，还会抑制RNA聚合酶Ⅲ，且抑制浓度远远高于RNA聚合酶Ⅱ[27]。Vaisius和Wieland[28]进一步研究发现有 α－Amanitin时，RNA 聚合酶仍能够合成二核苷酸，此表明鹅膏毒肽对RNA聚合酶Ⅱ是非竞争性的抑制。研究同还发现 α－Amanitin能够触发P53的表达[29]，这也将为鹅膏毒肽的治疗应用提供理论基础。

鬼笔毒肽和毒伞肽均能够与 F－actin(纤维形肌动蛋白)专一性地结合，在正常生理状态下，二者可打破F－actin和G－actin(球形肌动蛋白)聚合与解聚的动态平衡，形成大量F－actin毒肽复合体来破坏细胞骨架，而维持细胞形态、胞内运输、变形运动等方面发挥着重要作用的细胞骨架被鬼笔毒肽和毒伞肽破坏后，可诱导细胞凋亡[30]。

2.2 鹅膏菌肽类毒性及中毒症状

毒肽类中毒时引发腹痛、恶心、呕吐等症状，还会导致肝肿大、黄疸、肝功能异常、内出血以及内脏损伤，最终导致心、脑、肺、肝、肾等器官功能衰竭，甚至死亡。中毒过程大致经过潜伏期、胃肠反应期、假愈期、精神症状期、恢复期或死亡。鹅膏毒肽类中鹅膏毒肽属慢性毒素，但毒性较强，小白鼠致死量 LD50为 0.2 mg·kg－1～0.5 mg·kg－1，而人的致死量仅约0.1 mg·kg－1，鹅膏毒肽是真正的毒蕈毒物，其LD50相同物种一致，异种则不同，经由消化道吸收后，导致肝、肾坏死[31];鬼笔毒肽和毒伞素主要作用于真核细胞的肌动蛋白，毒力较弱，作用较快，口服鬼笔毒肽不会中毒，但腹腔或静脉注射试验动物2 h～5 h可致死[16];鬼笔毒肽与丝状肌动蛋白专一性结合，打破球状肌动蛋白、丝状肌动蛋白之间的平衡，形成大量的F－actin毒肽复合体[32]。鹅膏毒肽类毒素中毒后对肾脏、中枢神经系统、血管内皮细胞及其他内脏组织都造成损害，病死率高达90%～100%[2]。饮酒加剧某些毒蕈所含的类双硫仑样物质，毒力增强，使中毒程度加深[31]。

3 鹅膏菌肽类毒素的应用前景

多数人对鹅膏菌的认识是谈“鹅膏菌”色变，但鹅膏菌类及其它毒菌的毒素已成为研究热点，国内已鉴定30余种毒菌毒素，鹅膏菌肽类毒素是其中之一，特别是鹅膏菌肽类毒素对真核生物RNA聚合酶的活性具有专一性抑制作用，因此鹅膏菌肽类毒素在生物型抗病毒、抗菌、杀虫制剂方面应用前景显著[33]，同时可作为真核生物基因的表达、调控，细胞的组织结构和细胞定位的基础研究工具[34]。

3.1 抗癌抑瘤等新药物开发

当前患上恶性肿瘤的病例死亡率不断上升，发展中国家每年新增病例数最高达56%，估计到2015年全球将有1 500万新发病例[35]。大量的研究表明生物活性肽 (Biologically Active Peptides，BAPP)类对抑制肿瘤细胞增殖和转移有良好的功效，是开发高效治疗恶性肿瘤新药的研究新途径[36]。鹅膏菌α－Amanitin是RNA聚合酶Ⅱ的专一性抑制剂，在抗肿瘤方面有着很好的开发前景[22，37]。Grna[38]等发现通过反复向肿瘤注射α－Amanitin，可治愈氨基偶氮甲苯诱发的小鼠皮肤癌。王辉[39]采用MTT法从黄盖鹅膏分离纯化二羟鬼笔毒肽，并对H22荷瘤小鼠进行了体内抗肿瘤试验，表明二羟鬼笔毒肽对SGC和SMMC－772l体外细胞增殖无抑制作用，但对H22荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用，剂量为0.3 mg·kg－1时，抑瘤率可达65.15%。唐瑗璘[40]采用野生黄盖鹅膏和豹斑鹅膏中活性成分对人胃癌细胞 (MGC)和人结肠癌细胞 (Lovo)的体外抑制试验表明，2种鹅膏菌提取多糖对MGC胃癌细胞有较好的生长抑制效果。王玉玲[41]等研究表明玫瑰红鹅膏α－Amanitin、β－Amanitin和phalloidin等3种肽类毒素含量较高，具有抑制白色念珠菌的活性，是制备肽类毒素的新资源。这些前期研究基础给鹅膏肽类抗癌抑瘤等新药物开发提供了新的途径。加之，鹅膏菌种类多，为活性多肽类毒素提取提供了天然原材料。

3.2 生物防治方面应用

作物、果树等病虫害防治，主要采用菊酯类、氨基甲酸类、有机磷等杀虫剂，防效迅速，可残留量大，对人畜毒性大，对环境污染严重，易发生药害，严重影响作物、果树等的正常生长发育，生物性农药弥补了这些不足[42]。毒菌用于生物防治，已被列入“环境和谐农药”范畴之内。部分大型真菌有毒成分对作物、果树等有害昆虫及菌类有对抗作用[43]，Noman Mier等通过选取175种不同的大型真菌作为研究，表明有79种具有抑制昆虫生长的作用[44]。目前，国内具有杀虫活性的大型真菌约50多种，常见于牛肝菌科 (Boletaceae)、鹅膏科 (Amanitaceae)、白蘑科 (Tricholomataceae)，如鹅膏科中对蜚镰具有杀虫活性的有鳞柄白毒鹅膏菌(Amanita virosa)、残托斑鹅膏菌 (Amanita kwangsinsis)、条纹鹅膏菌 (Amanita phalloides)等。角鳞灰鹅膏菌 (Amanita fritillaria)对粘虫或小菜蛾表现出较高抑制和驱避作用，毒蝇鹅膏菌 (Amanita miscaria)对线虫有毒杀作用，橙黄鹅膏菌 (Amanita citrina)、赭盖鹅膏菌 (Amanita ocreata)等对夜蛾有较好的拒食效果[45]。另研究表明，应用毒肽类物质进行生物防治优势是用量少，对作物及环境无残留，无污染作用，且在一定的剂量范围才对人体产生有害作用。因此，利用鹅膏菌提取物进行生物防治，符合绿色农业生产要求，鹅膏菌毒素将是抗虫很好的药源[46，47]。

3.3 在细胞及分子生物等领域应用

利用鹅膏肽类毒素对细胞核 RNA酶的专一性的抑制作用，除了可用于研究生物科学中转录酶的动力学特性和分子机理外，对于基因工程中细胞定位研究也具重要意义，目前已经成为分子生物学研究的理想工具[48]。

4 结语

鹅膏菌肽类深入开发，需要多方面交叉学科知识，难度较大。但对其种类、结构及作用机理等的认识，一则有利于预防或解除引起人和动物的中毒危害;二则从抗癌抑瘤等药用新资源和抗虫抗病农业生物防治的角度出发，利用其特殊的生物活性功能，“变毒为宝”，使其更好地服务于医学及农业领域。同时值得注意的是鹅膏菌种类、形态变化多样，多数种还富含有毒蝇碱、鹅膏氨酸、异恶唑衍生物、异鹅氨酸和鬼伞素等毒素，因此在食用野生菌等相关品时，加以注意甄别，以免误食毒菌引起中毒等悲剧的发生。

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