高效液相色谱-荧光检测法测定复方刺五加片中维生素B1的含量

韦广辉 何林飞

高效液相色谱-荧光检测法测定复方刺五加片中维生素B1的含量

韦广辉 何林飞

目的 建立高效液相-荧光检测法测定复方刺五加片中维生素B1含量。方法 采用PAKC18柱, 流动相为甲醇-0.02M乙酸铵(35:65), 流速为1.0 ml/min, 进样量为10 μl, 荧光检测激发光波长为365 nm, 发射光波长为475 nm。结果 维生素B1含量在5~100 μg之间线性关系良好(r=0.9998), 平均回收率为98.12%, RSD=1.17%(n=6)。结论 方法准确、专属性强、灵敏度高, 为制定该制剂的质量标准提供依据。

高效液相-荧光检测法；复方刺五加片；维生素B1

复方刺五加片由刺五加浸膏、玉竹、黄芪、当归、维生素B1组成, 其质量标准收载于卫生部颁药品标准中药成方制剂第四册, 尚未建立维生素B1含量测定项目。文献报道［1］复方刺五加片中维生素B1的测定方法为高效液相-紫外检测法, 鉴于荧光检测具有较强的专属性和高度的灵敏性, 本实验根据维生素B1的理化特性与光谱特点, 参考吕惠卿［2］采用高效液相-荧光检测法对复方刺五加片中维生素B1进行测定, 实验证明, 该方法专属性强、灵敏度高、结果准确,为制定该制剂的质量标准提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪、G1321B荧光检测器(美国Agilent公司), XS205DU电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。维生素B1对照品(中国药品生物制品检定研究院, 批号：10039-200703, 供含量测定用), 复方刺五加片(市售：批号分别为20130203和130104)。甲醇为色谱纯, 其它试剂为分析纯, 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：PAKC18键合硅胶柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-0.02M乙酸铵(35:65), 激发光波长365 nm, 发射光波长475 nm;流速1.0 ml/min；柱温：25℃；进样量10 μl。

2.2溶液制备

2.2.1碱性铁氰化钾溶液 称取铁氰化钾0.2 g, 加水10 ml,摇匀后加入0.1 g/ml氢氧化钠400 ml, 摇匀, 即得。

2.2.2供试品溶液 取本品20片, 除去糖衣, 研细, 精密称取相当于1片的量, 置100 ml量瓶中, 加水适量, 超声提取5 min, 加水至刻度, 摇匀, 取溶液1.0 ml加水至10 ml, 加入碱性铁氰化钾溶液5 ml, 振摇2 min, 加入正丁醇10 ml, 振摇3 min, 放置, 取上清液过滤, 即得。

2.2.3对照品溶液 精密称取维生素B1对照品10.16 mg,置200 ml量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 即得对照品贮备液, 精密量取1.0 ml, 同供试品溶液制备项下制得对照品溶液。

2.2.4阴性样品溶液 称取除维生素B1以外的其他药材,照复方刺五加片的制备工艺和供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3干扰试验 按上述色谱条件, 分别精密吸取维生素B1对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μl, 进样测定,供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致, 阴性样品色谱图在此保留时间无干扰。

2.4线性关系考察 精密吸取维生素B1对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 ml, 分别置于25 ml的比色管中,各管加水至10 ml, 同供试品溶液制备项下的方法制得系列溶液。按上述色谱条件测定, 以浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 得回归方程为Y=10.900X-11.333, r=0.9998, 结果表明, 维生素B1在5~100 μg范围内具有良好的线性关系。

2.5精密度试验 取同一对照品溶液连续进样6次, 测定其峰面积, 其RSD=0.32%, 结果表明：该方法精密度较高, 能够满足实际样品的测定。

2.6重复性试验 取同一供试品6份, 按“供试品溶液制备”方法制备, 按上述条件测定, 结果的RSD=1.60%(n=6), 表明重复性好。

2.7稳定性试验 取同一供试品溶液, 按上述色谱条件每隔3 h测定1次, 共计测定5次, 结果表明, 在12 h内稳定。

2.8加标回收率试验 取已知含量的供试品细粉6份, 称样量相当于半片重, 置100 ml量瓶中, 分别加入维生素B1对照品贮备液50 ml(浓度为0.05 mg/ml), 同供试品溶液的制备项下方法操作, 测定其维生素B1的含量, 结果平均回收率为98.12%, RSD=1.17%(n=6)。

2.9样品含量测定 按“2.2.2”供试品溶液的制备方法和“2.1”色谱条件试验, 测定两批复方刺五加片中维生素B1的含量, 外标法计算含量, 结果2批样品含量分别为:批号：20130203, 4.92 mg/片, RSD1.43%;批号：130104, 4.97 mg/片, RSD1.28%。

3 讨论

3.1测定波长的选择 参考吕惠卿［2］测定波长, 并经G1321B荧光检测器多波长检测, 结果表明:维生素B1在λex 365 nm, λem 475 nm处有最大响应值, 故采用λex 365 nm, λem 475 nm作为检测波长。

3.2流动相的选择 选用甲醇-0.02M乙酸铵(35:65)作为流动相, 经实验证明, 维生素B1峰与相邻峰有效分离, 故选用甲醇-0.02M乙酸铵作为流动相［2］。

［1］ 杜波, 王金杰, 荆维荣.高效液相色谱法测定复方刺五加片中维生素B1的含量.中国伤残医学, 2011, 19(2):27-28.

［2］ 吕惠卿.高效液相色谱-荧光检测法测定复合维生素B片中维生素B1含量.中国药业, 2008, 17(15):24-25.

2014-05-16］

530022 广西食品药品监督管理局认证审评中心(韦广辉)；南宁食品药品检验所(何林飞)