L-茶氨酸的制备与生物活性研究进展

谷记平，袁海波，赵淑娟

(1.中国农业科学院茶叶研究所,浙江杭州 310008；2.杭州师范大学,浙江杭州 311121)

L-茶氨酸（L-Theanine），是在茶叶中发现的一种游离形式的非蛋白氨基酸，在其他植物中较为罕见。化学上系统命名为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺 （N-ethyl-γ -L-glutamine）， 分 子 式 为 ：HOOCCHNH2CH2CH2CONHCH2CH3，分子量为174.2。自然界中存在的茶氨酸均为L型，纯品为白色针状结晶，熔点217～218℃，极易溶于水，不溶于无水乙醇和乙醚，具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味。因L-茶氨酸所拥有的特殊风味和生物活性而具有重要应用价值，例如，茶氨酸能降低自发性高血压大鼠的血压[1]，能提高人脑中5-羟色胺、多巴胺和γ-氨基丁酸的浓度水平而起到保护神经的作用[2]等，并已成为茶叶中功能活性成分的研究热点。本文对近年来有关原料对L-茶氨酸含量的影响，以及L-茶氨酸的提取制备、生物活性等方面进行综述，以期帮助人们了解其研究进展，为相关研究工作者提供资料。

1 原料和饮用方法对茶氨酸的影响

茶树的生长状况、不同的原料来源对茶氨酸的含量有重要影响。随着茶树叶龄的增长，L-茶氨酸的含量下降[3]；当肥料中磷缺乏时，绿茶中茶氨酸的含量下降[4]；茶芽的茶氨酸含量比成熟茶芽高[5]。

Lu 等[6]在Caco-2 细胞模型实验中发现，纯茶氨酸以被动扩散方式通过细胞膜，具有良好的吸收性，而绿茶提取物中的茶氨酸因为茶叶中的其它组分影响其吸收性。在饮用方面，Keenan 等[7]发现，冲泡时间是提取L-茶氨酸的主要决定因素，添加少量的牛奶和糖对提取率没有影响。Baptist等[5]发现，欧洲唯一出产的Azorean 绿茶中茶氨酸的含量为3.1%，而中国大陆、日本、韩国和中国台湾绿茶中平均茶氨酸含量分别为1.52%、1.34%、0.89%、2.76%。Pijl 等[8]将 25～100 mg L-茶氨酸以茶、富含茶氨酸的茶、生物合成的L-茶氨酸水溶液三种形式提供给志愿者服用，然后分析血清中L-茶氨酸的浓度，发现所有组滞后时间均在10 min左右，吸收和代谢清除的半衰期分别是15 min和65 min，血清中茶氨酸含量与摄入剂量成比例，说明L-茶氨酸的摄入形式对吸收和代谢没有明显影响。

2 茶氨酸的制备

虽然超临界CO2萃取是一种高效的茶叶活性化合物提取方法，但是高昂的设备和生产成本限制了它的应用，与搅拌、超声、微波或酶处理相结合的浸泡提取方法是目前茶叶中活性物质提取的工业化方法。其中，微波处理对溶质内外同时加热，剧烈破坏植物组织和细胞而有利于有效成分溶出，具有升温快、提取效率高、溶剂消耗低、节能等优点，被人们普遍认为是提取茶氨酸的一种高效方法，但Vuong[9]研究发现，采用冲泡的方法即可提取出茶叶中80%的茶氨酸（10 mg/g），微波辅助提取法对茶氨酸的提取率没有显著影响，茶叶煮制液的酸碱度对茶氨酸的提取率有显著影响，煮制液最佳pH 值宜控制在3～5.3 之间[10]。

为了降低L-茶氨酸提取的成本，葛艳[11]从价格相对低廉的夏秋绿茶中提取茶氨酸，最佳提取工艺条件为料液比1:20，提取温度95℃，提取时间45 min，提取液经过NKA-Ⅱ树脂吸附、洗脱，茶氨酸得率可达到75.12%。Zhang 等[12]使用表面活性剂双水相系统对茶多酚的生产废水开展了茶氨酸的富集和提取研究。为了增大提取效益，周楚仪等[13]通过研究从茶叶提取茶多酚后的残留液中提取茶氨酸，采用凝絮、活性炭吸附等预处理，再经由阳离子交换树脂（732型）动态吸附、洗脱、浓缩、结晶而得，所制得茶氨酸粗品提取率为3.07%，纯度在99.5%以上，该项研究不仅能解决低成本高纯度茶氨酸的生产工艺，还可有效缓解困扰茶多酚生产厂家在生产过程中废液环境污染问题，变废为宝，显著提高企业经济价值和社会效益。Wang 等[14]开发了一种高效、流程简单的柱层析方法，从绿茶提取物中同时分离多酚物质、咖啡因和茶氨酸，纯度分别达到99%、98%和98%，实现了多物质同时提取。

3 茶氨酸的合成

如上所述，从茶叶中提取、分离L-茶氨酸，因其含量低，成本比较昂贵，因此需要从上游技术上解决L-茶氨酸的含量问题，然后再进行提取分离纯化，这样能更好地提高L-茶氨酸的制备效率。

陈银霞等[15]用L-谷氨酸为主要原料，以化学合成方法合成了L-茶氨酸。然而，化学合成固然易于工业化生产，且很大程度上降低生产成本，获得高纯度L-茶氨酸，但作为化学合成而得到的产品并不可取，无法和纯天然来源的高纯度L-茶氨酸产品做比较，同时化学合成中还存在消旋问题，容易产生DL-型消旋体。L-茶氨酸化学合成过程中副产物不可避免，茶氨酸化学合成的产品也存在一定的安全性问题，因此L-茶氨酸用作多种食品添加剂尚有广阔的研究空间。

人们尝试通过γ-谷氨酰胺转肽酶 （GGT）或谷氨酰胺酶进行酶法制备L-茶氨酸。孙帅[16]优化了重组γ-谷氨酰转肽酶粗酶液催化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸的反应条件，茶氨酸产量可达26.45 g/L，底物转化率可达86%。Chen 等[17]研究了由大肠杆菌BL21 分泌的枯草芽孢杆菌GGT 的酶学性质，得到其酶法合成L-茶氨酸的最佳条件。Yokoyama[18]和Itoh[19]分别报道了一种在介孔硅材料上固定化谷氨酰胺酶再由其催化合成L-茶氨酸的方法。Liu 等[20]采用静电纺丝技术得到平均直径为220 nm 的纳米纤维，用其固定化假单胞菌Pseudomonas nitroreducens LY，再由固定化的假单胞菌将谷氨酸钠转化为L-茶氨酸，转化率可达20.55%，得率可达10.74 g/L。李勤等[21]将来源于E.coli DH5α的 γ-谷氨酰转肽酶基因 （γ-Glutamyltranspeptidase,GGT）克隆到高表达质粒pET-32α中，并转化E.coli BL21，构建茶氨酸生物合成的工程菌，该工程菌在一定条件下诱导培养6 h，γ-谷氨酰转肽酶的酶活力可达(4.41±0.17)U/mL，是出发菌株E.coli DH5α的18.4倍；直接以工程菌为催化剂，在谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物、在一定条件下反应6 h，茶氨酸合成量可达12.6 mg/mL，L-谷氨酰胺转化率为41.05%。

4 茶氨酸的生物活性

近年对L-茶氨酸生物活性的研究主要集中在茶氨酸的抗氧化、对神经的保护作用和抗肿瘤方面。刘晓慧等[22]发现茶氨酸和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对ABTS 自由基及-OH 自由基的清除有协同增效作用，对DPPH 自由基无协同作用；它们还可以协同降低细胞内活性氧自由基及脂质过氧化水平，提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，从而协同降低细胞所受的氧化损伤。Jiang 等[23]发现L-茶氨酸剂量依赖型地抑制大鼠中CCl4引起的血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的活性和胆红素水平的升高以及组织病理学改变，能显著预防CCl4引起的脂过氧化产生及降低肝谷胱甘肽含量，使和抗氧化酶的活性下降，还能抑制氧化应激引起的包括血清中TNF-α和IL-1β升高在内的炎症反应；李桂兰等[24]发现，L-茶氨酸能提高H2O2损伤的L02 细胞存活率，减少乳酸脱氢酶（LDH）的渗漏，降低肝细胞凋亡，且通过抑制Caspase-3 的激活和PARP 的切割及Bax/Bcl-2 比值的升高而发挥抗凋亡的作用。Gong等[25]发现茶氨酸能延长秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）在热应激和氧应激下的平均寿命（分别延长12.8%和21.3%），但并不能延长正常培养条件下的线虫的存活时间。李桂兰等[26]研究发现，L-茶氨酸显著性保护肝细胞免受酒精引起的细胞毒性作用，抑制酒精引起的L02细胞的凋亡，抑制酒精处理的L02 细胞中线粒体膜电位的损失，防止细胞色素C 从线粒体释放。体内实验发现，L-茶氨酸能显著抑制酒精引起的ALT、AST、甘油三酯（TG）和丙二醛（MDA）的升高。有研究表明L-茶氨酸可通过稳定人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞线粒体膜电位，减轻叠氮钠诱导的细胞线粒体的损伤[27]，茶氨酸抑制摄食和胃排空作用可能与抑制下丘脑外侧核的NMDA受体和AMPA 受体有关[28]。Kim 等[29]发现茶氨酸能调节肿瘤干细胞的自我更新。SabryAttia[30]发现，用30 mg/kg 和60 mg/kg 的剂量饲喂大鼠12 d，茶氨酸无遗传损伤和细胞毒性作用，用茶氨酸预先饲喂大鼠，能显著减轻抗肿瘤药物伊立替康（Irinotecan）引起的髓细胞遗传损伤，且该效果呈剂量相关。

L-茶氨酸对心理、社会压力下的人与动物有显著的抗压效果。在美国，绿茶中的L-茶氨酸被作为一种膳食添加物出售，用来减轻人的精神压力，改善感知和情绪。Unno K 等[31]研究发现，早晨唾液中α-淀粉酶活力高的学生表现出显著性的特质焦虑，并且高α-淀粉酶活力与睡眠时间短有关，而摄入茶氨酸药片学生组的α-淀粉酶活力及主观应激水平均较低，说明茶氨酸的摄入能抑制初始的应激响应。Wise 等[32]发现L-茶氨酸能减轻吗啡依赖症的恒河猴体内的阿片样物质退化现象，认为茶氨酸能用于治疗阿片物质滥用和焦虑引起的相关精神紊乱。内皮NO 是调节内皮血管功能的关键物质，Siamwala 等[33]证明L-茶氨酸能促进内皮细胞中NO 的生成。Higashiyama等[34]发现L-茶氨酸对18个健康大学生志愿者的注意力和反应时间响应有显著影响。Jang 等[35]发现，低剂量的L-茶氨酸能部分逆转咖啡因引起的慢波睡眠下降，但是对咖啡因引起的失眠，L-茶氨酸的效果无剂量依赖关系。Ritsner 等[36]报道了将孕烯醇酮和L-茶氨酸配伍使用能用来治疗精神分裂症中的阴性但焦虑的症状。彭彬等[37]研究了L-茶氨酸对慢性不可预见性温和应激模型大鼠的抗抑郁作用，指出其机制主要与促进单胺类递质分泌有关。杨怡[38]研究发现茶氨酸和氟西汀均能有效改善抑郁模型大鼠的抑郁行为，并指出茶氨酸的抗抑郁作用机制可能和氟西汀类似。

L-茶氨酸在经济动物养殖中也有应用前景，据报道[39]L-茶氨酸可提高黄羽肉鸡生长前期肠道sIgA 含量、后期血清IL2 的含量及全期血清IFNγ的含量，从而增强其机体免疫功能。

对L-茶氨酸生物活动研究的开展为进一步更好地综合利用茶氨酸提供了广阔的空间，但是其潜在功效还有待广大相关工作者去研究和发现。

5 茶氨酸结构改性后的生物活性

就其直接的抗癌应用方面，L-茶氨酸本身也存在诸多的不足，基于L-茶氨酸的相关结构特性和生理活性，吴菲等[40]以茶氨酸为母体化合物，对其化学结构进一步改造，成功获得了它的衍生物茶氨酸氯香酰胺，在此基础上，进一步研究了茶氨酸以及茶氨酸氯香酰胺的抗癌作用。实验结果显示，随着浓度的增高，茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺对人乳腺癌MDA-MB-231 细胞体外生长的抑制作用逐渐增强，茶氨酸氯香酰胺的抑制作用要明显强于茶氨酸，茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺均能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平，同时上调促凋亡蛋白Bax 的表达水平，使Bcl-2/Bax 比率减少。此外，茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺均能抑制血管内皮生长因子受体VEGFR1 和核转录因子NF-κB的表达，而茶氨酸氯香酰胺的抑制作用要明显强于茶氨酸并推测茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺对这些蛋白水平的调节作用可能是抑制MDA-MB-231细胞生长的重要机制之一，并指出茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺对治疗高转移的人乳腺癌可能具有广阔的应用前景。季德鑫等[41]对茶氨酸进行了必要的结构修饰和改造，合成了茶氨酸的衍生物茶氨酸溴香酰胺，以L-茶氨酸作对照，评估茶氨酸溴香酰胺对人肝癌HepG2 细胞系体内外生长的抑制作用，并初步探究其作用的分子机制。实验结果显示，茶氨酸溴香酰胺抑制人肝癌细胞体内外生长的活性超过其母体化合物茶氨酸分别为3倍和4倍以上，对小鼠生长无明显毒性。茶氨酸溴香酰胺比茶氨酸更显著地抑制肝癌细胞生长因子受体c-Met 和抗凋亡的Bcl-2 等蛋白的表达；茶氨酸溴香酰胺能大大上调促进凋亡的Bax 蛋白的表达；茶氨酸溴香酰胺能抑制c-Met 信号传导通路，下调Bcl-2/Bax 蛋白比率可能是其作用的分子机制之一；由此认为茶氨酸溴香酰胺具有广泛应用于临床治疗和（或）辅助治疗人肝癌和其他癌症的潜力。此外，该作者还建立了动物肿瘤模型，与对照组茶氨酸和临床常用抗癌药物五氟尿嘧啶组相比较，评价茶氨酸溴香酰胺对荷瘤裸鼠人肝癌HepG2 肿瘤生长的抑制效果。张华荣等[42]研究了茶氨酸和茶氨酸溴香酰胺对人宫颈癌细胞体内外生长的抑制作用及其分子机制，实验结果显示，茶氨酸溴香酰胺抑制人宫颈癌细胞体内外生长的活性超过其母体化合物茶氨酸数倍，对小鼠生长无明显毒性；茶氨酸溴香酰胺作用的分子机制之一可能是其与抑制VEGFR1-Bcl-2/Bax 有关。建立的动物肿瘤模型试验也表现出茶氨酸溴香酰胺对荷瘤裸鼠人宫颈癌生长的抑制效果。

6 展望

自L-茶氨酸被发现以来，随着对L-茶氨酸研究的深入，越来越广泛的生物活性被发现，引起了人们的极大关注，而在继续发掘L-茶氨酸的其他有益于人体健康的生物活性方面还有大量的工作可做。目前人们在L-茶氨酸的制备方面主要是提取和酶合成方法，随着生物技术和分子生物学的日益成熟，基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等技术在L-茶氨酸生产方面将大有作为。待这些技术壁垒突破后，再进行高科技、低成本、大规模的茶氨酸生产，使其产品更加服务于广大民众，成为大众消费品。L-茶氨酸在贮藏、加工过程中的变化研究，L-茶氨酸与其他物质的协同效应研究也还留有大量的空白，儿茶素的甲基化一样在茶氨酸的改性方面研究和应用也有待进一步推进。以上领域都还有待广大茶叶、医学工作者去研究和发现。

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