环磷酰胺睾丸毒性研究进展

赵红乐 综述 金保方 审校

南京中医药大学男科研究所（南京 210023）

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环磷酰胺睾丸毒性研究进展

赵红乐 综述 金保方 审校

南京中医药大学男科研究所（南京 210023）

环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）具有较强的睾丸毒性，可诱导生精细胞凋亡、抑制精原干细胞增殖、分化，损伤生精细胞遗传物质及支持细胞，这与CP造成睾丸的氧化应激损伤有关。CP还可以通过抑制胆固醇转运蛋白StAR、睾酮合成关键酶3β-HSD、17β-HSD等表达，抑制睾酮合成。本文就CP造成的睾丸毒性，引起生精异常及睾酮合成障碍做一综述。

CP是一种抗肿瘤和免疫抑制类药物，目前常用于治疗各种恶性肿瘤及自身免疫性疾病，但是环磷酰胺作为细胞毒性和细胞抑制类药物，其毒副作用尤其是生殖毒性越来越受重视。研究表明环磷酰胺可导致大鼠睾丸和附睾的组织病理学改变，造成精子减少、活力减弱、畸形精子增多[1]，睾丸、附睾重量减轻，甚至会影响生育及后代的生长发育等[2]。睾丸是雄性的主要生殖器官，睾丸损伤后主要造成精子生成和睾酮合成的障碍。现就环磷酰胺睾丸毒性损伤的实验研究进展综述如下。

一、导致睾丸生精障碍

（一）生精细胞减少

正常生精小管中生精细胞的排列从外到内依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子。睾丸中任何生精细胞的缺失都会造成生精障碍。Elangovan等[3]研究环磷酰胺的生殖毒性与剂量的相关性，睾丸组织病理发现CP组小鼠精母细胞和圆形精子细胞显著减少，生精小管中未发现精子，而且随着环磷酰胺剂量的增加，生精小管也出现明显的萎缩。张长城等[4]采用流式细胞术检测小鼠在CP处理后各级生精细胞的比例，结果显示CP处理组小鼠单倍体和四倍体细胞比例明显减少，提示CP能引起减数分裂和减数分裂后阶段的生精障碍。有研究表明[5,6]，CP造成生精细胞减少，可能与引发小鼠睾丸组织环腺苷酸反应成分调节子（CREM）表达的减少有关。CREM在睾丸组织中高表达，其mRNA在粗线期精母细胞中就已经存在，在减数分裂后的生殖细胞中表达水平更高。CREM通过激活单倍体精子细胞中的结构调节基因，促进单倍体细胞变态，进而形成精子。CREM缺失小鼠，精子变态被阻断在早期，许多减数分裂后基因表达被抑制，精子计数减少46%，畸形精子增加两倍，甚至无精子产生[7]。

（二）生精细胞凋亡

CP诱导生精细胞凋亡以精原细胞和精母细胞最为显著，精原干细胞凋亡无显著改变。1997年Cai等[8]研究了CP对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响，原位缺口末端标记法（TUNEL）的结果表明：环磷酰胺可以诱导所有阶段的生殖细胞凋亡，以Ⅰ～Ⅳ和Ⅺ～ⅩⅢ阶段的精原细胞和精母细胞最为显著。何大维[9]选用仅有精原干细胞和支持细胞的1周龄大鼠，腹腔注射CP处理，结果1周组精原干细胞凋亡无显著增加，3周和9周组生殖细胞凋亡率显著高于正常对照组，推测可能是和这两个年龄组生精小管中含精原细胞和细线前期的精母细胞较多有关。

大量研究表明，CP诱导生精细胞凋亡主要与bax/ bcl-w、Fas/Fasl等基因凋亡通路有关。

在生精细胞凋亡的过程中，促凋亡蛋白bax起主要作用，而抗凋亡蛋白bcl-w抑制这一过程，bax/ bcl-w比值是生精细胞、支持细胞发生凋亡的决定性因素。黄宗轩等[10]采用腹腔注射CP，35d后免疫组化法检测小鼠睾丸生精细胞凋亡相关蛋白bcl-w、bax表达的情况，结果显示模型组生精细胞bax与bcl-w表达的积分光密度值（IOD）之比较正常组增大，提示CP可能通过bcl-w /bax途径诱导生精细胞的凋亡。

死亡受体Fas信号通路是哺乳动物生精细胞凋亡通过胱门蛋白酶的主要途径之一。宾彬等[11]用CP处理小鼠，用免疫组织化学SABC法检测Fas和Fasl蛋白在小鼠睾丸实质组织中的表达，结果与空白组比较，模型组Johnson评分偏低，Fas和Fasl蛋白表达率偏高，提示CP可能通过此信号通路诱导生精细胞的凋亡，导致生精障碍。

（三）抑制精原干细胞的增殖和分化

精子的发生开始于精原干细胞的增殖、分化，终止于成熟的精子生成。精原干细胞增殖、分化障碍会引起生精障碍。CP可以抑制精原干细胞的增殖、分化，主要与抑制mSCF/c-Kit、GDNF/Akt通路有关。

何大维等[9]选用仅有精原干细胞的1周龄大鼠，腹腔注射CP处理，TUNEL法检测生精细胞凋亡，结果精原干细胞凋亡无显著增加。但是1周龄实验组大鼠睾丸在CP处理后不同时间点的细胞周期S期细胞比例、精原细胞分化相关蛋白c-Kit蛋白表达水平均明显低于对照组。因此CP可能主要通过抑制精原细胞的增殖、分化，引起生精障碍，而不是促使精原干细胞的凋亡。代江涛等[12]证明CP可能通过下调睾丸组织中mSCF表达，导致生精细胞增殖指数下降，造成生精障碍。正常精原细胞上c-Kit蛋白与支持细胞分泌的mSCF干细胞因子结合，从而引起精原细胞的增殖、分化。这表明CP可能通过抑制mSCF/c-Kit通路，抑制精原细胞的增殖、分化。

在睾丸组织中Akt的激活可以产生对放疗和化疗的保护作用，主要是保护精原干细胞的生存和增加精原干细胞的自我更新[13]，Carmely等[14]通过对小鼠每周腹腔注射CP造成生精损伤，免疫印迹法检测Akt和GSK-3β（糖原合成酶激酶-3）的表达，结果显示CP组Akt和GSK-3β的磷酸化水平均下降。所以CP可能通过抑制AKt的表达影响精原干细胞的增殖。GDNF是由睾丸支持细胞分泌产生，它与精原细胞上的GFRa1/RET受体结合后，通过细胞内PI3K/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/AKT）信号通路，促进SSCs自我更新和增殖。常青等[15]通过对大鼠腹腔注射CP，免疫组化法检测精原干细胞相关分子OCT-4和GDNF表达水平，结果显示CP组GDNF表达明显减少，而OCT-4表达水平无明显变化。因此精原细胞的减少可能与CP导致GDNF表达下调有关。而且Akt通路的激活主要靠GDNF的作用，CP可能通过抑制睾丸支持细胞GDNF的分泌影响未分化精原细胞的增殖分化，造成生精细胞的大量减少。

（四）损害支持细胞功能

支持细胞对精子的发生起着支持保护作用，支持细胞结构或功能异常将导致生精障碍。陈安等[16]发现，CP处理的小鼠睾丸超微结构（第36d）显示支持细胞内质网扩大，有大空泡出现，溶酶体和脂滴的数量增多，细胞核的形态无明显变化，紧密连接完好。代江涛等[17]观察CP对幼鼠的生殖损伤情况，电镜下发现：精原细胞、支持细胞、肌样上皮细胞的线粒体肿胀、空泡化，出现髓样小体，间质水肿等，但睾丸间质细胞未见明显的结构异常。Sue等[18]用CP诱变小鼠，发现睾丸组织大多数生精小管出现生精上皮缺失、变薄，而且伴有支持细胞的空泡化。另外，CP对支持细胞产生的细胞因子GDNF[15]、mSCF[12]也有抑制作用。因此CP可能通过对支持细胞结构的损伤，导致支持细胞分泌的细胞因子减少，从而影响精子生成。

（五）损伤生殖细胞遗传物质

精子发生程中，要进行两次减数分裂，期间进行DNA复制、染色体重组、分离等。CP可以造成生精细胞DNA断裂、抑制DNA合成，引起染色体改变而造成生精障碍。

Codrington等[19]研究CP诱导精原细胞遗传物质损伤的阶段特异性，结果发现CP可以造成精子DNA 链断裂增加。而且，CP诱导的DNA损伤具有生殖细胞阶段特异性，最大的损伤效应在精子染色质重组期间的关键点即组蛋白高度乙酰化和转换蛋白沉积期，这可能是造成精子凋亡的重要原因。

增殖细胞核抗原是核酸复制中DNA 聚合酶的辅助蛋白，免疫组化显示增殖细胞核抗原的阳性反应，即表明该细胞处于分裂增殖状态。李杜娟等[20]采用小剂量长期腹腔注射CP处理小鼠，免疫组化显示模型组睾丸组织增殖细胞核抗原阳性细胞数明显减少，说明CP在较长时间内仍可抑制生精细胞的DNA复制，以致睾丸毒性作用。

Guo等[21]研究发现GSK-3β在哺乳动物减数分裂和精子发生中起重要作用，GSK-3β功能抑制会导致减数分裂过程中DNA的合成减少，从而影响精子发生。Carmely等[14]研究发现，CP可以抑制睾丸组织中GSK-3β的合成，造成生精障碍和生育力下降。

微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝损伤后在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。微核试验能检测化学毒剂诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两个遗传学终点。贾庆军等[22]发现CP处理后小鼠精子畸形率和生殖细胞微核率和对照组相比均有显著增加，说明CP对小鼠生殖细胞染色体有损害作用。端粒酶是维持端粒长度的逆转录酶，在保证染色体长度和细胞增殖分化中起重要作用。有学者[23]研究发现CP可能通过抑制睾丸组织中端粒酶活性，造成生精细胞染色体异常，造成生精障碍。

（六）睾丸氧化应激损伤

李杜娟等[24]用CP造成小鼠生精功能损害，发现小鼠睾丸超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶的活性减退，脂质过氧化产物丙二醛显著升高。环磷酰胺经肝微粒体P450酶系代谢生成有毒的亲电子物质，如丙烯醛等，这些亲电子中间产物与蛋白质、核酸、脂质等分子结合，导致重要酶系如自由基清除酶活性下降，造成自由基蓄积，并发生脂质过氧化反应，使生物膜结构破坏，造成生殖细胞损伤。同时，脂质过氧化产物丙二醛可抑制睾酮的合成及分泌[25]，这些共同参与了环磷酰胺对生精功能的损害。

二、导致睾酮合成障碍

睾丸间质细胞是合成睾酮的主要场所。睾酮的合成需要以胆固醇为原料，在胆固醇到睾酮的转化过程中，胆固醇从线粒体膜外在类固醇合成急性期反应蛋白(StAR)的参与下转运到膜内才能参加类固醇合成，胆固醇转到线粒体内膜后，经过P450scc、P450c17、17β-HSD、3β-HSD等相关酶的作用下最终转变为睾酮。在睾酮生物合成的调节因素中，任何一环节异常，即可最终引起睾酮合成的障碍。CP可以通过抑制胆固醇转运蛋白StAR、以及睾酮合成关键酶3β-HSD、17β-HSD等的表达，抑制睾酮合成。

Elangovan等[3]研究显示不同剂量的CP均能导致精子减少，而且还会降低雄性ICR小鼠的血清睾酮水平，且剂量越大，各组平均睾酮水平越低。张艳等[26]给予腹腔注射CP制备生精障碍大鼠模型。60d后测睾丸组织匀浆睾酮水平，结果显示模型组睾丸组织匀浆睾酮水平显著降低。Das等[27]研究发现CP可以导致实验鼠血浆T水平下降，并且伴有各种生精细胞数量的显著减少，且睾酮合成相关酶3β-HSD、17β-HSD 的表达均降低。刘振华等[28]采用CP 50mg/ kg，连续7d处理小鼠，第35天后免疫印迹法检测StAR蛋白的表达，结果显示模型组小鼠StAR蛋白的表达明显低于正常对照组，证明CP可能通过影响睾丸内StAR蛋白的活性，从而抑制胆固醇从线粒体膜外转导膜内而造成睾酮合成原料不足，引起睾酮合成障碍。

三、展望

总之，基于CP的睾丸毒性造成的生精障碍和睾酮合成障碍，目前被广泛用于雄性生殖损伤模型和中老年男性雄激素分泌减退等模型。CP引起睾丸损伤的具体机制有待进一步的研究，从而可以减少CP的毒副作用，可以更好的检验或研发保护睾丸损伤的药物，避免对人体的生殖损伤。

致谢：本课题受国家自然科学基金（81273760/ H2709）; 青年科学基金（81302969/H2709）资助

环磷酰胺; 睾丸毒性; 生精上皮; 睾酮

1 Kaur F, Sangha GK, Bilaspuri GS.Indian J Exp Biol1997; 35(7): 771-775

2 Trasler JM, Hales BF, Robaire B.Biol Reprod1986; 34(2): 275-283

3 Elangovan N, Chiou T J, Tzeng W F,et al. Toxicology2006; 222(1-2): 60-70

4 张长城, 贾亮亮, 李守超, 等. 中成药 2010; 32(12): 2052-2055

5 Kim W, Kim S H, Park S K, et al. Phytother Res2012; 26(9): 1418-1421

6 Oh MS, Chang M S, Park W, et al.Reprod Toxicol2007; 24(3): 365-370

7 郭睿著. 男性生殖基础与实验室研究. 北京: 军事医学科学出版社, 2009: 99-100

8 Cai L, Hales BF, Robaire B.Biol Reprod1997; 56(6): 1490-1497

9 何大维, 李旭良, 岳丽琴, 等. 中华男科学杂志 2006; 12(5): 387-390, 393

10 黄宗轩, 张奇峰, 左懿, 等. 广西医科大学学报 2012; 29(2): 203-205

11 宾彬, 王杰, 陈定雄, 等. 时珍国医国药 2010; 21(4): 907-908

12 代江涛, 李旭良, 魏光辉, 等. 重庆医科大学学报 2006; 31(3): 334-337

13 Rasoulpour T, DiPalma K, Kolvek B,et al. Endocrinology2006; 147(9): 4213-4221

14 Carmely A, Meirow D, Peretz A,et al. Human Reprod2009; 24(6): 1322-1329

15 常青, 杨震, 王燕蓉, 等. 基础医学与临床 2013; 33(7): 824-828

16 陈安, 孙鸿喜, 熊艾君. 湖南中医学院学报 2000; 20(1) : 2-3

17 代江涛. 重庆医科大学 2006: 27

18 Sue Marty M, Singh NP, Stebbins KE,et al. Toxicol Pathol2010; 38(2): 244-257

19 Codrington AM, Hales BF, Robaire B.J Androl2004; 25(3): 354-362

20 李杜娟, 赵建龙, 徐正顺, 等. 中国组织工程研究与临床康复 2007; 11(2): 238-241

21 Guo TB, Chan KC, Hakovirta H,et al. J Androl2003; 24(3): 332-342

22 贾庆军, 刘天鹏, 冯长龙, 等. 第五届中国肿瘤学术大会论文集 2008: 109-110

23 代江涛, 李旭良, 魏光辉, 等. 中华小儿外科杂志 2007; 28(1): 31-34

24 李杜娟, 王家富, 黄庆玉, 等. 中国临床康复 2005; 9(27): 74-76

25 Ghosh D, Das U B, Ghosh S,et al. Drug Chem Toxicol2002; 25(3): 281-292

26 张艳, 沈楠, 齐玲, 等. 中国中西医结合杂志 2013; 33(3): 361-364

27 Das UB, Mallick M, Debnath JM,et al. Asian J Androl2002; 4(3): 201-207

28 刘振华, 谢京, 萧云备, 等. 中华男科学杂志 2013; 19(3): 210-213

（2014-03-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.018

R 697.22