核糖核苷酸还原酶小亚基M2在肿瘤中表达及意义的研究进展

王兆永，刘佰纯，田晓丰，池 琦，魏丽娟，王春田，曹 宏＊

核糖核苷酸还原酶小亚基M2在肿瘤中表达及意义的研究进展

王兆永1，刘佰纯1，田晓丰2，池 琦1，魏丽娟1，王春田1，曹 宏2＊

（1．吉林大学第二医院，吉林长春130041；2．吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）

核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide Reductase．RR）在DNA合成、修复及细胞增殖中起关键作用，近来被认为是癌症治疗的重要靶点。RR包含3个亚单位，分别是大亚基RRM1、小亚基RRM2和小亚基p53R2。RRM2亚基不仅和DNA的合成密切相关，对恶性肿瘤生物学行为、转移潜能和肿瘤耐药的产生都具有影响．在绒癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、直肠癌、乳腺癌等多种人体癌组织中发现RRM2的表达水平有异常升高的情况，抑制RRM2的高表达，可以降低RR酶的活性，抑制癌细胞的生长，增加肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤转移和逆转耐药。针对RRM2在肿瘤中高表达的抗肿瘤药物主要有：3－AP、吉西他滨、RRM2的小干扰RNA、RRM2反义寡核苷酸及RRM2的反义cDNA，通过对RRM2的深入研究将有助于在基因水平及分子水平上揭示肿瘤的发生、发展、浸润和转移的机制，为肿瘤的治疗提供一个新的策略。

1 RRM2的结构和功能

肿瘤的形成和生长均与细胞的生长相关，而细胞的分裂、增殖及分化有赖于DNA的合成，核糖核苷酸还原酶（RR）存在于所有的生物细胞中，它是唯一催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸的酶，它能够将核糖核苷酸的5＇－二磷酸催化转化成2＇－脱氧核糖核苷酸，而脱氧核糖核苷酸是DNA合成和修复的原材料，因此RR是DNA合成和修复通路中的限速酶［1－3］。在核苷酸代谢过程中发挥核心作用，对细胞的分裂、增殖及分化具有重要作用。根据金属辅助因子不同，RR可分为三类，而基于序列同源性和别构调节机制，第I类又可进一步分为la，lb，和Ic三个亚类，人、鼠和大肠杆菌等的RR属于la亚类。RR全酶结构包括大亚基α和小亚基β，形成α2β2的异四聚体结构后方具备活性。现已鉴定出人的RR全酶由一个大亚基Ml（RRM1）和一个小亚基（RRM2或P53R2）组成［4］。大亚基RRM1包括底物和变构效应物位点，且含有直接供给电子的琉基，控制着底物的特异性及酶活性的开／关，是肿瘤抑制基因，也是吉西他滨（Gemcitabine）的分子靶点。RRM2基因位于人染色体2p25→p24，全长10．3kb［1，5］，它是一个同源二聚体，由8个长螺旋结构互相折叠形成，其内包含两个相同的二价铁核心和一个酪氨酰自由基，这些对催化过程中触发电子运输非常必要，通过酪氨酸残基的苯环形成特异的自由基而参加催化反应，其具有携带接触抑制区，控制底物转化的功能［6］。研究表明，RRM2除参与DNA合成外，对恶性肿瘤生物学行为、转移潜能和肿瘤耐药的产生都具有影响［7］。日本研究人员于2000年首先克隆出RR的另一个小亚基P53R2，它的基因在结构上和RRM2有80%以上的一致性［4，8，9］。当DNA损伤后P53R2可取代RRM2，与RRM1形成RR全酶，为DNA合成提供dNTPs，并进一步修复DNA［10］。

2 RRM2在肿瘤中的表达及意义

有研究应用传统的免疫组化方法，首次在妊娠滋养细胞疾病（GTD）中检测出了RRM2的表达部位和表达水平。近年来郑州大学第二附属医院崔金全教授用免疫组化、免疫印迹和反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法，即从mRNA和蛋白水平证明RRM2在葡萄胎和绒癌细胞中存在高表达。Mark S等［11］使用小干扰RNA（small interfering RNA，即siRNA）介导的RNA干扰，通过抑制胰腺癌细胞中RRM2表达，增强吉西他滨诱导的细胞毒性，同时构建了胰腺癌的原位移植瘤模型，通过全身给药抑制肿瘤的RRM2表达，结果表明RRM2的siRNA与吉西他滨的有协同作用，显著抑制肿瘤的生长，增加肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤转移。他们研究证实了肿瘤细胞中RRM2的表达对吉西他滨化疗耐药至关重要，并首次证明了以siRNA全身给药为基础的治疗，可增强核苷类抗癌药的疗效；另有研究表明在胰腺癌（尤其是不能手术的胰腺癌）患者中，RRM2的表达也起着关键的预测作用［12］；最近藤田等［13］的研究表明，对手术切除的胰腺癌患者检测RRM2mRNA的表达水平，如其表达水平较低，则可提示这类患者使用吉西他滨化疗有效；Fisher［14］从一个前瞻性数据库中随机选择95例在2000年1月至2008年10月之间接受了胰十二指肠切除术胰腺癌患者的肿瘤标本，并对肿瘤样本中RRM1，RRM2进行免疫组化分析，最终得出结论：RRM1表达与总生存期（OS）无关，肿瘤中RRM2的高表达与胰腺癌切除后无复发生存率（RFS）和总生存期（OS）减少相关，这些生物标志物可能有助于个性化的辅助治疗。但是xie等［15］的研究似乎得出了与之相矛盾的结果，他们的研究小组对117例接受了肿瘤切除手术的胰腺癌患者的肿瘤标本构建肿瘤组织芯片，同时采用免疫组织化学方法测定RRM2蛋白表达量，并分组进行阴性、阳性对照，采用Kaplan－Meier法估计总生存期（OS）和无进展生存期（PFS），采用Cox比例风险模型研究RRM2表达价值，最终得出结论：在胰腺癌组织中的RRM2蛋白表达既不能判断可切除胰腺癌患者预后，也不能预测这些患者辅助吉西他滨治疗是否获益。Morikawa等［16］对117例膀胱标本的组织芯片进行RRM2免疫染色。观察14例非肿瘤性膀胱上皮，均未见RRM2染色阳性；4例低级别膀胱上皮癌（UC）也未见RRM2染色阳性；83例高级别膀胱上皮癌（UC）中，69例RRM2染色阳性，其中3例鳞状细胞癌RRM2染色均呈阳性，伴有淋巴结转移的13例膀胱上皮癌（UC）中，12例RRM2染色阳性。在进行了根治性切除术膀胱癌患者患者中，RRM2过度表达与肌层浸润显着相关。对15例异型反应的膀胱炎及25例原位膀胱癌的小的活体标本进行RRM2免疫组织化学染色，结果在15例异性反应膀胱炎标本中1例RRM2染色阳性（6．7%），在25例原位膀胱癌标本中24例RRM2染色阳性（96%）。他们的研究结果表明，RRM2蛋白频繁的过度表达可能在膀胱癌中发挥作用，它将是一种新型的膀胱癌的诊断标志物和潜在的治疗靶点。Morikawa［17］研究小组同样对胃癌进行了研究，他们选取了114例胃癌标本，应用RRM2单克隆抗体和组织芯片进行免疫组织化学分析来确定RRM2蛋白表达情况，并对RRM2的表达与临床病理因素之间的相关性进行统计学分析。再利用RRM2小干扰RNA转染3个胃癌细胞系，MKN－1，MKN－7和SNU－719（分别为低分化，分化良好和Epstein－Barr病毒相关GC），用MTT法检测其对细胞生长的影响。结果：检测114例胃癌标本中52例RRM2蛋白表达，而在正常胃小凹上皮RRM2不表达，RRM2的表达与肌层浸润，血管侵犯，淋巴结转移呈正相关。应用小分子干扰RNA抑制RRM2表达，结果表明在所有这3个的胃癌细胞系的细胞生长均减少。Morikawa研究表明RRM2蛋白表达与胃癌恶性潜能有关，它在胃癌细胞的生长发挥了重要作用，RRM2可以作为一种新颖的诊断／预后的标记物和治疗胃癌的一个潜在的治疗靶分子。为了进一步研究RRM2和结直肠癌（大肠癌）的相关性，Liu等［18］将结肠癌的临床研究结果同RRM2的表达联系起来，他们收集了437例结直肠癌标本进行回顾性的研究，其中217例来自美国希望之城？？国家医学中心（COH），220例来自浙江大学。他们应用免疫组化（IHC）来确定的RRM2蛋白表达水平，用实时定量PCR来验证。通过siRNA下调RRM2表达水平显著并特异的抑制细胞的生长，也降低了HT－29和HCT－8细胞的粘附能力。结果表明RRM2是预测大肠癌的一个独立预后因素，也是一个潜在的判断结直肠癌的化疗反应好坏的预测指标。另一个来自中国上海微创外科中心（上海交通大学医学院附属瑞金医院）研究小组研究了RRM2亚基在大肠癌中的作用及其在紫外线引起的DNA损伤修复中的作用。结果表明，RRM2过度表达与浸润深度，低分化型，转移阶段呈正相关。RRM2过度表达可能与大肠癌的进展相关，通过siRNA使RRM2基因沉默，可以抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭，RRM2在大肠癌的浸润和转移可能发挥重要作用，这是一个潜在的治疗大肠癌的策略。研究人员得出一个结论，RRM2在大肠癌的发生和紫外线引起的DNA损伤修复中可能是一个促进因素。他们的研究表明，RRM2基因沉默抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭，RRM2可能在大肠癌的浸润和转移中发挥了重要作用，抑制其功能可能是一个潜在的治疗大肠癌的策略。也有研究表明，RRM2在乳腺癌和乳腺癌前病变中也存在的高表达，乳头浆液性溢液涂片RRM2免疫组化染色可作为乳腺腺癌的鉴别手段［19］。最新的研究也表明RRM2在小细胞肺癌、胆管癌、上皮性卵巢癌组织中的表达均有不同程度的增多，因只少数报道，有待于进一步研究证实。

3 针对RRM2的抗肿瘤药物研究现状

RR抑制剂类是目前最有开发前景的抗肿瘤药物之一［20］。抑制RR的机制主要有2点：①直接灭活RRM2亚单位的酪氨酞自由基。②通过离子络合作用对RRM2亚单位的离子中心发生不可逆性抑制作用。3－氨基吡啶－2－甲醛硫代缩氨基脲（3－AP）是目前最有效的RR抑制剂，对多种人类及小鼠肿瘤均有显著疗效，并能增加顺铂、环磷酞胺等抗肿瘤药物的活性，但对其毒理作用机制，尤其对生殖毒性和遗传毒性研究，尚不够全面系统。吉西他滨（Gemcitabine）是另一种核苷酸还原酶抑制剂，主要作用于肿瘤细胞的DNA合成期，即细胞周期的S期，在一定的条件下，可以阻止Gl期向S期的进展。目前临床主要用于治疗局部进展性或转移性小细胞肺癌和不能手术的晚期胰腺癌等。近年来siRNA抗癌治疗已成为研究的热点，关于RRM2的siRNA研究也越来越多。众多的实验证明小分子干扰RNA（siRNA）可以增加胰腺腺癌对吉西他滨的敏感性，并减轻肿瘤细胞的侵袭性。据报道利用具有高效转染反义核苷酸功能的最新脂质体将寡核苷酸转染至肿瘤细胞内，明显抑制了细胞生长，降低了RRM2蛋白、mRNA的表达。研究证实，RRM2反义寡核苷酸及RRM2的反义cDNA能显著减少可诱导系统中RRM2蛋白的表达，降低酶活性，抑制癌细胞生长，逆转耐药［21］。就在今年八月美国食品药品管理局（FDA）批准美国国家癌症研究院（NCI）可以对Lorus公司先导化合反义药物－GTI－2040与罗氏的希罗达（Xeloda），即卡培他滨（Capecitabine）进行治疗转移性乳癌的Ⅱ期临床试验。这是FDA所批准由Lorus和NCI合作进行的第二项临床试验计划。第一次的试验计划是将GTI－2040与阿糖胞苷合用治疗急性髓性白血病，目前在美国还有一个关于GTI－2040治疗肾脏癌的Ⅱ期临床正在进行中。也有报道将RRM2抑制剂和siRNA技术结合起来对其进行体内和体外抑制肿瘤细胞增殖的研究［22］。肿瘤组织尤其是高危和晚期患者RRM2高表达，可能会影响药物治疗效果，增加治疗失败的可能性。对高危和复发患者选择抑制RRM2基因蛋白表达和RRM2酶活性的药物，将有助于提高患者的治疗效果。

目前肿瘤主要治疗手段仍然是手术、放疗和化疗，虽然综合治疗较以往提高了患者的生存率，但有些肿瘤发现即为晚期，失去手术机会，放疗及化疗存在着盲目性，此外化疗的耐药也是临床医生及患者必须面临的重要问题。近年来，随着基因组学及分子生物学的飞速发展，肿瘤基因靶向治疗作为一个新型的治疗策略，它具有准确锚钉肿瘤部位，在局部保持相对高浓度，对正常组织细胞作用较小的特点，已经成为肿瘤治疗的一个热点。实验证明在多种肿瘤细胞中RRM2的表达水平明显高于正常细胞，它可用来预测某些肿瘤化疗的疗效，也可作为某些肿瘤的新型的诊断标志物及潜在的治疗靶点。利用RRM2的siRNA、反义寡核苷酸和反义cDNA能够抑制某些肿瘤中RRM2的表达，能够抑制这些肿瘤细胞的生长逆转某些化疗药的肿瘤耐药性。我们有理由相信，通过对RRM2的深入研究将有助于在基因水平及分子水平上揭示肿瘤的发生、发展、浸润和转移的机制，为肿瘤的治疗提供一个新的策略。

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王兆永（1979－），硕士研究生，临床医师，主要研究方向肝胆肿瘤临床与基础研究。

2013－02－27）

本刊来稿中参考文献编写存在的主要问题

1007－4287（2014）02－0341－04

＊通讯作者

本刊来稿中参考文献的编写存在以下主要问题，望作者在投稿时注意：①文献不新：除了个别涉及到方法学的历史文献外，一般应选择与论文密切相关的近3～5年的文献，其中综述文章更应有近1～2年的新文献。在本刊来稿中，许多作者在写论文之前，并没有系统地查阅最新文献，论文选题可能近几年报道并不少，但引用的文献却多为10年以上的文献，近5年的文献很少，使论文的先进性受到很大影响。②所选参考文献与本文关系不大：医学论文引用的文献应该是与论文中的方法、结果和讨论内容密切相关，不可缺少的文献，对于那些已是本学科常识性的内容，不必再通过引用参考文献来说明。有的来稿在讨论中牵强地引用一些可有可无的文献，有些甚至与本文没有明显的关系，使文章内容不突出。③文献编写无规律：本刊参考文献采用“顺序编码制”，即根据正文中引用参考文献的先后顺序，在文后用温哥华格式编写，并要求在内文相应的地方用上标的形式标出。在本刊来稿中，有一部分作者在文内没有标出参考文献的引用位置，或参考文献的著录格式不对、著录项目不全。④引用非正式发表的或尚未发表的文献：一般来说，“会议资料”、“内部资料”及“待发表”等文献均不能算为正式的参考文献，均不宜引用。