玉米酒精糟（DDGS）中抗生素检测的研究

■程传民 柏 凡 李 云 魏 敏 冯 娅 王宇萍

（农业部饲料质量监督检验测试中心（成都）四川省饲料工作总站，四川成都610041）

中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国，抗生素不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，但同时也引起药物残留、细菌耐药性等负面问题，对动物、人和生态环境造成严重危害。2010年美国食品药品管理局（FDA）报导，46个玉米酒精糟样本中有4个样品检出12种抗生素当中的一种或多种。为了了解我国玉米酒精糟中抗生素的含量情况，对79个样品先采用酶联试剂盒进行初筛，再通过液相色谱和液质联用仪对国产26个和进口24个针对6种我国常见抗生素氨苄青霉素、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、土霉素、链霉素进行了定性、定量检测。

1 酶联试剂盒的检测结果

使用酶联试剂盒，对β-内酰胺类、四环素族、链霉素和双氢链霉素进行了测定，β-内酰胺类酶联试剂盒（REAGEN公司）最低检出限为1.4 μg/kg，同时可检测：氨苄青霉素、青霉素G、羟氨苄青霉素、氯唑西林(邻氯青霉素)、苯甲异恶唑青霉素；四环素族酶联试剂盒（R-Biopharm公司）最低检出限为15 μg/kg，同时可检测：四环素、罗利环素、金霉素、地美环素、土霉素和强力霉素，链霉素和双氢链霉素酶联试剂盒（R-Bio⁃pharm公司）最低检出限为5.0 μg/kg.同时可检测：链霉素和双氢链霉素。按照试剂盒饲料中抗生素检测操作说明进行了79个样品的检测，3种抗生素检测率分别为：75.9%、83.5%和62.0%，检测结果见表1。

表1 酶联试剂盒检测结果

2 按现有饲料中抗生素的方法检测结果

根据GB/T 23385-2009饲料中氨苄青霉素的测定采用高效液相色谱法，检出限为1.0 mg/kg。GB/T 22259-2008饲料中土霉素的测定采用高效液相色谱法，检出限为0.5 mg/kg。DB13/T 1384.3-2011饲料中链霉素的测定，检出限为0.02 mg/kg。对国产26个和进口24个DDGS样品进行了检测，结果全部未检出。上述3种方法检出限较高，DDGS中抗生素的含量可能低于方法的检出限，为了进一步了解DDGS中抗生素的情况，进行了参照畜产品及最新报道中抗生素的液质方法的检测。

3 参照畜产品及最新报道中抗生素的液质方法检测结果

3.1 β-内酰胺类的测定，提取：称取样品5 g，准确加入25 ml提取液（乙腈80%），振荡后离心。净化：C18依次经过3 ml乙腈和5 ml水活化。取上清液10 ml过C18柱同时收集于15 ml玻璃离心管内，挤干，于40℃下氮气吹至体积小于1 ml，加水定容至1 ml。过0.22 μm滤膜后，供液质联用仪测定。液相参考条件：色谱柱：SB C18（50×2.1 mm，1.7 μm）。流动相：乙腈和0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱。流速：0.3 ml/min。质谱参考条件：电喷雾离子源；正离子扫描。检测方式；多反应监测；干燥气温度：350℃;干燥气流量：13 L/min；雾化气压力40 psi。检测药物母离子定性、子离子对及碰撞诱导解离电压、碰撞能量见表2。

表2 4种抗生素的质谱参数

采用上述方法，对国产26个和进口24个DDGS样品进行了β-内酰胺类的检测，全部样品均未检出氨苄青霉素、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林，但发现很多单个通道峰面积很大的样品，怀疑是β-内酰胺类的降解产物。

3.2 土霉素的测定，提取：称取5 g样品，加入30 ml盐酸溶液（0.05 M）。振荡提取后离心。上清液备用。净化：用甲醇和水5 ml依次活化HLB小柱。取10 ml备用液过柱，用水5 ml淋洗，加压抽干。用甲醇3 ml洗脱。洗脱液用氮气吹干，用30%甲醇水1 ml溶解残余物，过0.22 μm滤膜上机检测。液相参考条件：色谱柱：SB C18（50×2.1 mm，1.7 μm）。流动相∶乙腈和0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱。流速：0.3 ml/min。质谱参考条件：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；干燥气温度：350℃;干燥气流量：13 L/min；雾化气压力40 psi。检测药物母离子、子离子对及碰撞诱导解离电压、碰撞能量见表3。

表3 土霉素的质谱参数

采用上述方法，对国产26个和进口24个DDGS样品进行了土霉素的检测，全部样品均未检出土霉素。也未发现单个通道中有峰面积较大的色谱峰出现。在酶联检测四环素族的检测率较高的情况下，怀疑含有其他四环素族的抗生素。

3.3 链霉素的测定，提取：称取5 g样品，加入10 mM磷酸二氢钾缓冲溶液（含0.4 mM EDTA和2%三氯乙酸）20 ml。振荡提取后离心。取上清液10 ml调其pH值至7.5～8.0备用。净化：用甲醇和水5 ml依次活化CBX小柱，取全部备用液过柱，用水5 ml淋洗，加压抽干。用10%乙酸甲醇溶液3 ml洗脱。洗脱液用氮气吹干，用流动相1 ml溶解残余物，过0.22 μm滤膜上机检测。液相参考条件：色谱柱：正相色谱柱SiL。流动相：乙腈和0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱。流速：0.3 ml/min。质谱参考条件：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测。干燥气温度：350℃;干燥气流量：13 L/min；雾化气压力40 psi。检测药物母离子、子离子对及碰撞诱导解离电压、碰撞能量见表4。

表4 链霉素的质谱参数

采用上述方法，对国产26个和进口24个DDGS样品进行了链霉素的检测，全部样品均未检出链霉素。也未发现单个通道中有峰面积较大的色谱峰出现。在酶联检测链霉素的检测率较高的情况下，怀疑含有其他氨基糖苷类的抗生素。

4 结论

DDGS中3类抗生素的酶联试剂盒检出率均较高，使用现有的仪器方法没有检测出DDGS中含有氨苄青霉素、青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、土霉素、链霉素。由检测方法等原因本研究对其他抗生素没有进行仪器检测。是否含有其它抗生素有待进一步研究。

建议，我国能给出在DDGS发酵过程中可以用的抗生素的种类范围、使用限量以及使用规范。在美国，仅仅批准了维吉尼亚霉素作为DDGS生产中可用的辅助剂，而且给出了0.5 mg/kg的添加限量。建立DDGS中抗生素的多组分检测，可以快速的检测出DDGS中的抗生素。

（参考文献12篇，刊略，需者可函索）