水产养殖中多糖的非特异性免疫研究

■ 丛方地 王庆奎 周文礼 邢克智

（天津市水产生态及养殖重点实验室，天津农学院基础科学学院，天津300384）

1 水产养殖中的免疫多糖

来自于动物、植物和微生物的一些多糖及结合多糖可显著提高水产幼苗的成活率，促进水产动物的健康生长，增强它们的抗病能力，而且生产成本低廉、绿色安全，非常有利于精益化水产养殖业的可持续发展[1]。因此，多糖的研究在国内外水产养殖领域中受到高度重视。由于多糖的多种生理功能主要源于其对水产动物的非特异性免疫作用，所以研究工作集中在免疫多糖在水产养殖中的应用及作用机理[2]。日本、美国、德国、俄罗斯等国对于免疫多糖的研究仍处于领先地位，我国主要对中草药多糖的非特异免疫进行了研究[3]，并且在水产养殖领域的研究较多[4]。这是因为我国有着悠久的中草药应用和研究历史，这为提取多糖、研究多糖对水产动物的生理作用提供了得天独厚的条件[5]。尽管国内外对水产养殖中免疫多糖的研究已有一定的基础，但是研究范围和深度，如多糖质量控制和作用机理等“瓶颈”问题，仍需继续探索[6]。为此，我们分析了免疫多糖在水产养殖领域中的研究现状，展望了多糖非特异性免疫机理研究的趋势，希望对水产养殖科学的健康发展有所裨益。

2 多糖的非特异性免疫特性研究

多糖对水产动物的生理作用，主要体现在其诱导增加机体的免疫因子数量和活力上[7]。饲喂适量香菇多糖可显著提高罗非鱼的非特异性免疫能力[8]，黄芪多糖可明显提高异育银鲫血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶活性[9]。口服实验证明，海藻硫酸多糖和壳聚糖能有效改善刺参体内氧化酶和水解酶系统[10]，黑鲷肠道菌株产胞外多糖能使黑鲷血液的红细胞、白细胞数量和血红素浓度、淋巴细胞比率均有显著升高[11]。经注射实验，黄芪多糖可使刺参体腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶活性及补体C3含量均有显著增高[12]，壳聚糖、酵母多糖、牛蒡寡糖等也能显著提高刺参体腔液中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性[13]，浒苔多糖可显著提高扇贝体内超氧化物歧化酶和溶菌酶活性[14]。通过饲喂或体腔注射，当归多糖能显著促进石斑鱼头肾白细胞的增殖，增强石斑鱼对爱德华菌的抵抗能力[15]；云芝蛋白多糖能激活罗非鱼头肾巨噬细胞，显著增强其抵抗爱德华菌的能力[16]。采用浸润或注射，酵母细胞壁多糖能明显提高罗氏沼虾重要脏器组织中超氧化物酶、酸性磷酸化酶、多酚氧化酶等的活性[17]。通过离体培养，黄芪多糖和香菇多糖对鲤鱼免疫细胞有明显诱导激活作用[18]。这些研究中，在有效的剂量范围内，均需要一定的免疫激活时间，并且激活后能保持一定的有效期，这正是非特异性免疫的特征。但多糖使用方式、激活时间和有效激活量各有差异，因此多糖的非特异性免疫激活研究尚需要进一步的细化和比较，将经验性的资料转化为规律性的科学理论。

3 多糖非特异性免疫作用途径

多糖非特异性免疫机理的深入研究在于发现多糖在分子水平上的非特异性免疫调节机制，研究细胞因子的激活途径和多糖与受体的作用[19]。在饲喂实验中，发现脂多糖引起锦鲤头肾细胞中白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α的mRNA的表达，相应地引起头肾巨噬细胞活性和血清溶菌酶杀菌能力的增强[20]。体外实验也表明，香菇和黄芪多糖作用头肾巨噬细胞后，都能显著增强IL-1β的体外诱导表达，从而显著促进鲤外周血淋巴细胞的增殖[21]。进一步研究发现，添加在鱼饲料中的大分子量碱溶性根枝藻多糖，能够通过细胞内蛋白激酶信号传导途径，诱导鼠源巨噬细胞（J774A.1）内白介素IL-1基因的表达[22]；凡纳滨对虾血细胞的蛋白激酶抑制剂研究进而反证了脂多糖通过蛋白激酶信号传导途径对非特异性细胞免疫的激活[23]。而这种细胞内免疫激活传导信号源于多糖与其细胞受体的结合，部分鱼类的甘露糖受体全长或部分序列已经被克隆出来[24]，栉孔扇贝的脂多糖钟样受体信号通路的关键成分与功能已经被系统地研究，发现了该受体所依赖的特定接头分子[25]。但是，在水产养殖领域中多糖非特异性免疫作用途径的研究还非常有限，需要继续研究多糖受体通路及细胞内免疫信号传导途径的多样性，这对于阐明多糖的生理机制具有重要而深远的科学意义。

4 多糖非特异性免疫影响因素

多糖种类、剂量、作用对象与条件等都影响多糖非特异性免疫作用。如，赤芝、灰树花、香菇的胞内多糖，通过注射和饲喂实验，都能显著提高日本沼虾的巨噬细胞活力和免疫相关酶活力，但其中以灰树花多糖的效果最好；并且发现，体长4.0～4.5 cm的虾，每只注射6 μl浓度为l%的多糖溶液为宜；而且给对虾注射时，其抗菌酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶等活力的提高更显著[26]。在腹腔注射史氏鲟的研究中，壳聚糖相对于水苏糖、酵母聚糖和米糠脂多糖，能更有效地提高血液中淋巴细胞α-醋酸萘酯酶和溶菌酶活性[27]。在中华鳖饵料中添加酵母细胞壁多糖时，以每千克鳖重1 g左右为宜，如超过1.5 g时，反而对中华鳖的免疫刺激作用会逐渐降低[28]；又如，在银鲫饲料中添加过量云芝多糖时，银鲫白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清超氧化物歧化酶活性和补体C3、C4的含量反而低于对照组[29]。酸碱条件也会影响多糖的作用，在碱性条件下（pH值10），酵母多糖可使刺参肠道内噬菌指数、溶菌酶活性、酸性磷脂酶活性增加，而噬菌率与碱性磷脂酶的活性无明显改变；在酸性条件下（pH值5.5），刺参肠道内噬菌指数变化不明显，而溶菌酶、酸性磷脂酶及碱性磷脂酶活性增加[30]。多糖非特异性免疫的影响因素反映了多糖作用的复杂性，同时也暗示今后还要在多糖的理想用量、复合使用和使用条件等方面做更广泛的研究，这也是对多糖非特异免疫机理研究的重要内容之一。

5 多糖非特异性免疫的广谱性

除了常见的爱德华菌[15]，免疫多糖能有效提高水产动物对其他多种致病菌的非特异性免疫能力。如，芦荟多糖能刺激花鲈、石斑鱼、红鳍笛鲷、卵圆鲳鲹及美国红鱼产生对S.iniae海水株HD-1攻毒菌的非特异性免疫应答，分析发现动物血清溶菌酶含量明显提高[31]。点状念珠藻胞外多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有比较明显的抑制效果[32]。投喂鲫鱼灰树花多糖药饵，其离体白细胞吞噬活性，吞噬细胞杀灭肠形点状气单胞菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌活性都有显著提高[33]。甘草多糖对嗜水气单细胞菌等6种常见水生动物致病菌的抑杀效果良好[34]。此外，多糖还具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒及促进水产动物生长、提高肌肉品质、改善肠道功能、调节微生物种群等多种功效[35]。并有采用免疫多糖有效提高南美白对虾的抗病力、防治南美白对虾红体综合症的成功实验实例[36]。这些研究表明，多糖的非特异免疫是广谱性的，其研究空间广大。更多的研究可以从多角度对多糖的非特异免疫机理进行探索，有助于更充分地阐明多糖的生理机制。

6 多糖非特异性免疫相关研究

多糖非特异性免疫相关研究主要在于促进水产动物生长的研究。如，除了能够提高水产动物的非特异性免疫能力，饲喂黄芪多糖可以显著地促进齐口裂腹鱼的生长[37]和改善异育银鲫的肌肉品质[38]；云芝多糖可使罗非鱼增重率和特定生长率显著增高[39]；酵母多糖可显著影响黄河鲤的生长[40]；壳多糖能抑制气单胞菌繁殖，提高虾苗的成活率，促进虾苗生长[41]；水果胶质多糖能稳定饲料性质，并促进小龙虾的增长[42]。进而，多糖促生长的机理研究也受到了应有的重视，在饲喂裙带菜盐藻依多糖的研究中发现，澳洲肺鱼幼鱼体长、体重和肌肉纤维生长都极显著地增加，其原因在于该多糖对肌肉生长限制因子有亲合并失活作用[43]；研究还发现香菇多糖能有效改善幼建鲤肠道菌群数量[44]，酵母多糖可使河鲶肠道的褶皱程度、肌肉层厚度和杯状细胞数量增加[45]，这些生理变化都有助于动物生长。此外，多糖还具有促进免疫器官发育、减少肠道病原菌数量、促进有益菌繁殖、提高抗应激能力、防治疫病及增强动物抵抗寄生虫能力等功效[46]，如，混配多糖可有效改善肝功能[47]，黄芪多糖可诱导吉富罗非鱼热应激蛋白基因表达，提高抗应激能力[48]；海参体壁硫酸多糖甚至可以影响神经干细胞的迁移和分化[49]，湿冷黄杆菌多糖蛋白可用于开发疫苗，治疗细菌冷水病和虹鳟鱼鱼苗综合症[50]。上述生理变化是在多糖作出非特异免疫应答时所表现出来的相关效果，也是非特异性免疫的重要特性之一。当前主要局限于对其相关作用效果进行研究，对其生理机制还需要进行深入探索，以助于揭示多糖非特异性免疫的作用机理。

7 非特异性免疫与多糖结构

尽管对免疫多糖在水产养殖中的应用与机理研究已经取得了一定的进展，但对多糖、肽聚糖和脂多糖的非特异性增强效应在分子水平上的免疫机理还不够明确[51]。为此，国内外都非常重视多糖分子结构与其非特异性免疫之间的构效关系研究，所以多糖的纯化和结构分析成为了对多糖非特异免疫研究的关键工作之一。人们通过纤维素柱层析[52]、凝胶柱层析[53]、复合酶法[3]及温酚法[54]等方法纯化了多糖并分离了多糖的亚组分，研究了组分的总糖含量、单糖种类与比例及相应的免疫相关性等。如，研究发现酵母多糖的活性与其含有较多的甘露糖相关[55]，当归多糖中β-吡喃环单糖残基是其生物学活性的基础[52]，分子量较大、碱溶性的根枝藻多糖组分的非特异免疫效果更好[22]，在多糖免疫鲤鱼的实验中，发现带有1～6糖苷键连接分支的多糖具有更好的非特异性免疫效果[4]。但是，由于单糖组成、构型、糖苷键、螺旋构象和分支情况、主链连接方式、分子量大小及取代基团的性质和取代度等诸多结构因素都会影响多糖的免疫活性[56]，因此还需继续深入、细致地进行多糖构效关系的研究工作。多糖非特异免疫构效关系的研究，对于设计和选择免疫多糖分子是非常关键的，其相关研究工作也是非常有挑战性的，在将来的研究中将是免疫多糖的前沿和热点。

8 免疫多糖研究的发展趋势

综上所述，免疫多糖资源丰富、种类繁多、绿色安全而又具有优异的非特异性免疫活性，决定免疫多糖在水产养殖中的应用前景非常广阔。就当前水产养殖中多糖的研究现状来看，关于多糖作用的效果、途径、影响因素、广谱性、相关性和构效关系研究等都是多糖非特异免疫研究的重要组成部分，受到了应有的重视并已取得了一定的研究进展。为探明多糖的非特异性免疫机理、科学有效地开发和使用多糖免疫增强剂仍需继续做好一些关键性的工作。①多糖的分离纯化：纯化多糖是研究单糖链接次序、多糖空间构象和活性机理的前提，但多糖通常与众多类似物混存于生物组织中，难以纯化，所以采用新方法分离纯化多糖是多糖免疫机理研究的基础。②多糖与受体之间的作用：在多糖非特异性免疫机理研究中，由于受体的多样性及模式识别的复杂性，需要选择有代表性的研究对象，探明多糖与受体之间的分子识别机制，这是多糖免疫机理研究的核心。③多糖的选择性制备和活性研究：多糖的选择性制备，如发酵制备多糖[57]，可以得到相对纯净的多糖，有利于设计和简化研究，有利于多糖核心工作的研究。④多糖作用的影响因子研究：虽然多糖的使用方式、使用量、使用时段、生效时间及酸碱环境等已有了相应的研究，但还缺乏系统化和规律化的研究资料，这些资料是多糖作用机理的外在体现，也是充分发挥多糖生理作用和科学使用多糖的重要保障。⑤多糖的非特异免疫相关性研究：多糖的促生长、改善组织器官功能等研究是多糖非特异免疫研究的重要组成部分，对于全面揭示多糖的非特异免疫作用机理是必不可少的，也是健康水产养殖所必需的研究内容。