牛磺酸对MDCC-MSB1细胞端粒酶表达水平及其活性的影响

■于洋洋 陈 涛 邱淑敏 林淑梅 胡建民 汉丽梅

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866）

牛磺酸(Taurine)又名2-氨基乙磺酸，是一种由含硫氨基酸转化而来的条件必需氨基酸。在生物体内参与一系列的生理学过程，在抗自由基、抗氧化和抑制肿瘤方面发挥了很大的作用。肿瘤发生是一个多基因参与、多水平作用的过程，这一过程还需要一定的时空顺序，它的发生与原癌基因和抑癌基因的失控有关，这些分子事件共同控制着正常细胞的恶性转化过程。端粒酶是一种特殊的逆转录酶，由端粒酶催化亚基（chTERT）和端粒酶RNA（TR）两部分组成，它能将端粒DNA加至真核细胞染色体末端，对肿瘤细胞获得无限增殖进而成为永生化细胞起重要作用[1],是肿瘤标志物之一。本研究旨在探讨不同浓度的牛磺酸对鸡MDCC-MSB1细胞系chTERT的mRNA表达水平及其端粒酶活性的影响，为牛磺酸抗肿瘤作用机制研究及临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

MDCC-MSB1细胞系（本研究室保存）；MEM培养基，RPMI1640培养基（GEBICO），胎牛血清（四季青公司），RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DL 2000 Marker（TaKaRa公司），Go Taq Green Master Mix（上海生工）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成），Chaps裂解液，牛磺酸（北京嘉康源化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛磺酸适宜应用浓度测定

应用含牛磺酸分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的MEM培养基培养原代鸡胚成纤维细胞24 h后，采用MTT法检测培养细胞的增殖情况，细胞增值率=(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)%，经SPSS软件统计分析确定牛磺酸应用的适宜浓度。

1.2.2 细胞培养与试验分组

RPMI1640培养基（10%胎牛血清）培养MDCCMSB1肿瘤细胞，于对数生长期进行细胞计数并分组，应用含牛磺酸分别为2%、1%、0.5%、0%的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下于细胞培养箱进行培养，每个浓度组4个重复，培养24 h，离心收集细胞。

1.2.3 chTERT基因mRNA表达水平检测

参照NCBI中已发表的鸡chTERT基因序列，在保守区进行引物设计（chTERT up：5’-GTCAGAGC⁃GAAGTCATCACAAGAAT-3’，chTERT down:5’-TG⁃GCAAAACTCTGAAGTGACAAC-3’，产物大小为119bp），以β-actin为内参基因（β-actin up：5’-ACGTCG⁃CACTGGATTTCGAG-3’，β-actin down：5’-TGT⁃CAGCAATGCCAGGGTAC-3’，产物大小为282 bp），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

采用TaKaRa公司RNA提取试剂盒对MDCCMSB1总RNA进行提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA的完整性，并测定浓度。采用反转录试剂盒进行cDNA合成，（条件为：42 ℃，2 min，37 ℃，15 min、85 ℃，5 s）。PCR扩增体系：6 μl RNase Free dH2O，1 μl cDNA1，引物各0.5 μl，Go Taq Green Master Mix 10 μl，共 20 μl（β-actin 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环，延伸72℃ 10 min；chTERT：94℃预变性5 min，94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30个循环，延伸72 ℃ 5 min）。

取5 μl PCR产物进行电泳，紫外灯下观察结果。

1.2.4 TRAP银染法测端粒酶活性

采用的改进TRAP法进行端粒酶活性测定[2]，相对端粒酶活力＝总条带强度/0.02 amol R5扩增产物条带强度×20。

2 结果与分析

2.1 牛磺酸应用适宜浓度检测结果

分析结果表明：与对照组（0%）相比，2%、3%，4%牛磺酸组的细胞增殖率呈上升趋势，其中3%牛磺酸组细胞增殖率上升显著（P＜0.05），4%牛磺酸组增殖率上升极显著（P＜0.01），5%，6%，7%牛磺酸组的细胞增殖率降低，其中7%牛磺酸组增殖率降低极显著（P＜0.01）。牛磺酸应用适宜浓度分析结果表明，牛磺酸使用对细胞的安全浓度范围小于2%。根据实验发现3%、4%的牛磺酸会对鸡成纤维细胞产生促进生长的效果，5%以上的牛磺酸会对成纤维细胞产生毒性作用（见表1）。因此2%以下牛磺酸浓度为适宜应用浓度。

2.2 chTERT mRNA表达水平分析结果

表1 牛磺酸应用适宜浓度分析结果

分析结果表明，与对照组相比，不同浓度添加牛磺酸组培养的MD细胞chTERT mRNA表达水平均降低，其中1%、2%牛磺酸组的chTERT mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）（见表2、图1）。

2.3 端粒酶活性分析结果

分析结果表明，与对照组相比，不同浓度添加牛磺酸组的细胞端粒酶活性均降低，其中1%、2%牛磺酸组的细胞端粒酶活性极显著降低（P＜0.01）。牛磺酸可能具有下调MD细胞端粒酶活性的功能，且随着牛磺酸浓度的增加，端粒酶活性随之降低。

表2 牛磺酸对MD肿瘤细胞的chTERT表达水平测定与分析结果（10-2）

图1 chTERT基因半定量RT-PCR产物电泳结果

图2 各组MD肿瘤细胞端粒酶活性电泳结果

表3 相对端粒酶活性测定与分析结果

3 讨论

近年来，国内外有关端粒酶与肿瘤的研究表明，在肿瘤发生的多个阶段，端粒酶都参与了肿瘤细胞凋亡和基因组稳定的调控过程。端粒酶在肿瘤组织中检出率很高，其活性的表达与细胞衰老和某些疾病，尤其是与肿瘤的发生、发展有密切联系，因此，端粒酶已经被公认为目前已知的最为广泛的肿瘤标志物之一[3]。端粒酶催化亚基TERT是决定端粒酶活性的主要因素，其表达水平的高低决定端粒酶活性的高低[4]。TERT过表达可引起细胞的永生化，肿瘤细胞中端粒酶活性越高，细胞的恶性程度也越高[5]。

此外，许多研究表明牛磺酸能抑制肿瘤细胞的增殖，其抑制作用可能是通过调节基因表达和蛋白合成、增强机体免疫、提高机体抗氧化能力、增强DNA损伤修复、抑制肿瘤细胞增值等途径实现的[6-8]。本研究应用添加不同浓度牛磺酸的培养基培养MDCCMSB1细胞，并对其端粒酶活性、chTERT基因mRNA表达水平进行分析，来探讨牛磺酸在抑制肿瘤细胞凋亡方面的作用，研究结果预示牛磺酸可能通过抑制肿瘤细胞端粒酶的表达水平，在一定程度上起到抑瘤作用。