胚胎干细胞和诱导性多能干细胞体外分化成精子细胞的研究

李明颖 综述 李永刚 审校

云南省第一人民医院生殖遗传一科（昆明 650032）

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞体外分化成精子细胞的研究

李明颖 综述 李永刚 审校

云南省第一人民医院生殖遗传一科（昆明 650032）

据世界卫生组织（WHO）统计，世界上有10%～l5%的育龄夫妇患有不孕不育症，其中由男性方面因素导致的不孕症约占30%[1,2]，无精子症在男性不育患者中的比例约为10%～15%。目前对于无精子症病人的主要治疗方法如下：（1）对于梗阻性无精子症可以从睾丸组织获得精子或者精子细胞，行单精子胸浆内注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）来治疗。（2）对于先天性生殖异常或者后天环境、辐射、医学治疗等原因造成的永久性生殖异常，临床上常推荐采用供精人工授精进行治疗[3,4]，因而无法获得含有自身遗传物质的后代。原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）和胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）以及胚胎生殖细胞（embryo germ cells, EGCs）相关，如果能体外培养得到生殖细胞，此类患者将有希望获得拥有自己遗传基因的后代。

ESCs是指在组织生殖层形成前，从早期胚胎中分离出的的具有多能性的干细胞系[5]。ESCs通常是从移植前的囊胚中获得的，在体外合适环境中展示出无限的多能性。过去几年的研究表明鼠源ESCs（mESCs）可以在体外发育成PGCs，并且在继续培养中，可以偶然的形成早期精子细胞或者卵原细胞，卵原细胞可以形成卵泡或者卵巢类似结构以及卵子[6]。

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是由体细胞诱导产生的多能性干细胞，同ESCs表现出相似的多能性水平。iPSCs不仅在形态、生长特性、干细胞标志物表达方面与ESCs非常相似，在克隆形成、基因表达、表观遗传、分化潜能等方面也与ESCs高度相似，体外可以形成3种生殖层细胞类型，注射体内后可以形成畸胎瘤。

一、生殖细胞发育过程

生殖细胞（Germ cells，GCs）来源于PGCs，将遗传信息通过基因组带给下一代。多数脊椎动物原肠胚期的原始生殖细胞分布于肠道、卵黄囊或尿囊基部的内胚层细胞间，在发育中沿肠壁迁移，进入背肠系膜，最终达到正在发育的生殖嵴处，并和生殖嵴的中胚层细胞共同组成睾丸或卵巢。许多年来，组织非特异性碱磷酸酶（TNAP）的活力被用于标记PGCs，及其最终进入性腺原基的生殖嵴的过程[7]。这种酶在PGCs、ESCs、EGCs和胚胎源肿瘤细胞中都有高表达，这些细胞都具有全能性。人类PGCs的迁移发生于孕5周到8周，而在很多个体中，PGCs在迁移到生殖嵴后会大量增加，最终成为不迁移的生殖母细胞[8]。男性中[4]，生殖母细胞被阻断在有丝分裂G0期直至出生。出生后，静止的细胞进入有丝分裂周期分化成精原细胞，之后分裂并分化成精母细胞，进而减数分裂成精子细胞，并发育成成熟精子。在睾丸中会保留一小群精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）。这些细胞会持续的进入减数分裂期并产生单倍体细胞。而在女性中，PGCs被阻断在第一次减数分裂Ⅰ期。出生后，继续减数分裂后被阻断在减数分裂Ⅱ期直至排卵前[4,9]。

二、生殖细胞发育相关基因及其在ESCs和iPSCs诱导中的作用

体外分化生殖细胞的一个主要困难是缺乏合适的将生殖细胞从体细胞中区分出来的分子标志物。目前已知的生殖细胞发育相关基因阐述如下。

Blimp1：近期研究表明，早在受精后6.25d，Blimp1蛋白的表达可在少至6个外胚层细胞中检测出来，作为生殖细胞的标志[8]。目前研究认为，Blimp1是胚胎中最早可以识别出PGCs的基因。小鼠中Blimp1的突变会导致PGCs数量的减少，以及正常迁移行为的缺失，而在很多个体中，PGCs在迁移到生殖嵴后会大量增加，最终成为不迁移的生殖母细胞。

BMP4、8b：在小鼠中，生殖细胞的形成由对胚外外胚层包括生长因子协同作用发出的信号做出的反应而诱导，尤其是BMP4和8b，两者都是转移生长因子βTGF-β亚家族的成员[10]。成熟BMP4蛋白结合在异源受体复合物和下游的Smad蛋白的二聚体，其信号也通过二者传递。BMP4、8b单独是不能诱导PGCs从外胚层中培养出来，但结合后可以，提示各种BMPs的信号通路可以通过不同的受体复合物发生和BMP4非常相关的BMP2表达于PGCs形成时的内脏内胚层，并且BMP2的失活会导致PGCs数目的减少，揭示其在（至少在小鼠中）内脏内胚层PCGs发生中的作用[10,11]。

fragilis、Stella：干扰素诱导蛋白fragilis具有抗增殖作用，可以在PGCs中延长细胞周期。由于生殖细胞的命运早已被决定，fragilis在其中只有短暂的表达，但是该基因也在ESCs和EGCs中表达，提示其在全能性状态中的作用。Stella在全能性发展中有类似的作用，并和染色体重塑或者RNA过程相关。其在卵子、移植前胚胎以及生殖细胞源肿瘤中都有表达[12]。

VASA：免疫组化分析表明，小鼠VASA同源基因（Mvh）蛋白特异的表达于迁移到生殖腺后的PGCs和经历配子形成过程的生殖细胞中，直到减数分裂后期[13]，为生殖细胞标志基因。

Oct4 ：POU区域转录因子OCT4在囊胚内细胞团和ESCs中对于维持全能性很重要。研究表明，Oct4的缺失会导致细胞凋亡[14]。在人类胎儿组织，Oct4在迁移的PGCs中高表达，同时，在人类生殖细胞肿瘤和EG细胞中也高表达[15]。

c-Kit：酪氨酸激酶受体c-Kit及其配体干细胞因子（SCF），对两性生殖中PGCs的维持是必不可少的。在成人睾丸，c-Kit受体在分化的精原细胞中重新表达，但在精原干细胞不表达，精原干细胞中，在促卵泡激素的刺激下，Sertoli细胞表达SCF[16]。

DAZL：DAZ基因在无精子症中缺失，Y染色体DAZ基因缺失的男性只有极少或者没有生殖细胞，提示他们在生殖细胞形成或者保持方面有缺陷。DAZ的同源基因DAZL（DAZ-Like）在不同种的生物中被发现，对于人类，不论男性女性，其生殖细胞发育过程中都需要该基因[9]。

视黄酸（RA）：RA基因是减数分裂的参与基因并控制男性或者女性表型的分化。低水平的RA会阻滞生殖细胞进入减数分裂，高水平会诱发减数分裂。一些研究表明，卵巢和睾丸有同样的诱发减数分裂的信号系统但是调节时机不同。RA信号是卵巢中诱发生殖细胞进入减数分裂的关键的调节子，通过诱导生殖细胞特异基因Stra8的表达。相反，胎儿睾丸中，Cyp26b1蛋白的表达调节RA代谢成失活状态，使该过程阻滞。出生后睾丸中，RA由靠近精原细胞的支持细胞产生并运输，同发育的卵巢一样，由于Stra8蛋白表达上调，诱发进入减数分裂[4]。

因此，Blimp1, Stella, fragilis, c-Kit, VASA（Mvh）和DAZL基因的表达在生殖细胞分化过程中起到很重要的作用，他们的表达是具有阶段特异性的，因此可以在生殖细胞发育的不同阶段提供可靠的识别。

精子在发生和分化过程中存在着阶段特异性的标志分子，如多能型标志蛋白Nanog、Oct4、Sox2、GDP3[14,15]，PGCs/减数分裂前期标志蛋白Fragilis、Stella、Blimp1、c-Kit、HILI[8,10-12,16,17]，减数分裂各阶段标志蛋白DAZL、VASA、CXCR4、PIWI1、UTF1、CDH、SCP3、Prot1、TP1[13,18,19]等，大多数用于PGCs的标志蛋白在ESCs中也存在，如Fragilis,Stella, DAZL, c-Kit等[20]。

研究表明，在培养液中加入重组BMP4有利于人类ESCs（hESCs）的获得和维持，DAZL、VASA等的过表达可促进正在分化的hESCs/iPSCs形成PGCs[21]，同时，Toyooka等在模拟体内生殖细胞分化系统产生的拟胚体细胞中发现BMP4的表达，认为BMP4在ESCs到PGCs的分化中起到重要作用[22]；Eguizabal等在脐带血和角化细胞诱导产生的ESCs和iPSCs细胞系中，均检测到Oct4基因的表达，且生殖细胞标志基因VASA检测为阴性。在加入RA诱导培养诱导分化后，Oct4基因表达下调，VASA表达上调[23]；Lu等认为，c-Kit可以在ESC功能性监测中作为标志物，其参与的酪氨酸激酶信号通路在维持ESC不分化状态中起到重要作用[24]；Saiti等认为c-Kit在调节ESCs的生存和分化方面具有和在生殖细胞系中类似的作用[25]；Nayernia等在ESCs中利用RA诱导筛选出Stra8阳性细胞，在形成的拟胚体中检测到Mvh基因的表达，并在之后形成的单倍体生殖细胞中检测到Oct4、fragilis、Stella、Mvh、Dazl的表达，同时c-Kit表达增强[26]；Yang等研究表明RA在iPSCs分化成雄性生殖细胞的过程中起到减数分裂诱导因素的作用[27]。

三、体外培养ESCs、iPSCs及其分化为精子细胞的研究进展及存在问题

2004年，Clark等报道从hESCs形成的拟胚体中分化出表达VAS 和SCP3的GCs[20]；Payer使用Stella-GFP标记的mESCs培养表明，不同于Oct4和TNAP的均匀分布，ESCs会产生非常明确的Stella阳性的细胞群[28]。在一些细胞中会出现明显的Oct4和Stella的重叠表达，表明有这种标志物结合的生殖细胞可能是生殖细胞类似的ESCs。这表明，可能可以在ESC培养系统加入诱导因子，形成干细胞微环境，进一步诱导生殖细胞的发育。维持这些复杂小环境的合适的生长因子和荷尔蒙微环境可能取决于培养系统的一些成分[9]；Geijsen等用带有GFP的Oct4基因进行跟踪，GFP标记的mESCs生成单倍体精子后，通过流式分离，行ICSI注射入卵子，可形成囊胚[29]；Toyooka等利用mESCs筛选出的Mvh阳性细胞研究体外生殖细胞的分化，将筛选出的细胞和雄性生殖腺细胞共移植入小鼠睾丸后检测到有标记的精子形成[22]。Nayernia等利用传统2阶段培养系统从mESCs得到有类似尾部结构的雄性单倍体生殖细胞，并检测到顶体的形成、核聚集的出现。将该细胞移植入生殖细胞缺失的小鼠睾丸后，在管腔中生成精子，行ICSI后形成胚胎移植后得到活产小鼠，并分析了在分化细胞中的一些印记基因的甲基化状态，发现在小鼠中甲基化没有正确的表现，大多数在一个月内死亡[26,30]。尽管如此，该结果仍表明从胚胎干细胞体外衍生的雄性配子可正常受精并发育成个体。在hESCs研究中，Aflatoonian等[19]发现hESCs在分化的拟胚体中检测到成熟生殖细胞特异基因（VASA、Oct4、DAZL、PRM2、c-Kit、SCP3等）的表达。

在iPSCs研究方面，2006年，Takahashi等[31]通过在小鼠成纤维细胞用反转录病毒导入Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc4个基因成功获得鼠源iPSCs（miPSCs）。2007年，Takahashi等和Yu等分别在人类成纤维细胞中使用同样的4个基因或者Oct4、Sox2、Linm28、Nanog获得人类iPSCs（hiPSCs）[32,33]。目前研究表明，人类、非人类灵长类动物和鼠的iPSCs都可以在体外分化出VASA和DAZL阳性的PGCs[34,35]。Hayashi等研究表明，iPSC在体外分化成PGCs类似的状态，移植到不孕小鼠睾丸后，可以产生有功能的单倍体精子细胞[36]。Cai等体外加入RA诱导miPSC细胞分化成Oct4、c-Kit、Mvh阳性的PGCs类似细胞，将GFP标记的miPSCs和胎鼠睾丸细胞混合移植入雄性小鼠体内后，检测到源于miPSCs的生精小管组织形成[37]。Yang等利用hiPSCs体外诱导分化产生雄性GCs，将其和睾丸细胞混合注射到小鼠背部皮肤后，可以重建生精小管[27]。然而，在其他哺乳动物中，PGCs恢复睾丸不育的功能极其有限。另外，睾丸功能环境也直接影响到移植后PGCs的发育结果，因而，对于睾丸环境完全失活的病人来说，这种PGCs移植的方法并不可行，最好的方法是iPSCs体外诱导生成精子后，行ICSI进行助孕治疗。Easley等在体外从hiPGCs直接分化得到精子分化各阶段的单倍体细胞，甚至得到圆形精子[38]。Eguizabal等在诱导产生的hiPSCs中，检测到Sertoli细胞和Leydig细胞标志物阳性的细胞，提示初级睾丸位的形成，同时检测到类似于睾丸中早期精原细胞、精原细胞和早期人类精子细胞标志物的表达分布（CD9+/CD49F++/CD90-），并通过FISH检测到雄性单倍体细胞的形成[23]。

目前，hESCs的获得有两种途径：（1）捐赠IVF胚胎发育成囊胚后，从内细胞团（inner cell mass, ICM）获得ESCs；（2）通过体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer, SCNT）获得胚胎形成囊胚后，从ICM获得ESCs。第一种方法仍然无法得到继承了父本基因的后代，而第二种方法在人类疾病治疗中由于伦理问题的考虑，不能予以实施，且在动物模型中的实验表明，将自体体细胞核转移到卵子中获得无性生殖ES细胞的效率很低，约为3%～5%，产生定制配子的效率将更低[39]。hESCs在培养中，为了保持其不分化状态，需要饲养层细胞和动物来源的培养成分，这些可能带来病原体的交叉感染；其次，hESC在长时间培养中表现出基因组的不稳定性和无法预知的分化方向，可能会导致生理上的伤害或者群体中累计的基因突变[39]；在临床应用中，由于用于男性不育后续治疗上存在异体排斥的风险，需要患者长期进行免疫抑制剂的治疗[40]。

相对于ESCs，iPSCs有着更多的优势：iPSCs源于自体细胞，设计道德伦理方面的问题较少，并且可以用于构建病人特异性的细胞治疗模型，在可能的后续应用治疗中解决了异体排斥的安全问题。然而，在临床应用中，iPSCs仍然存在一些问题：（1）iPSCs获得效率低；（2）在诱导过程中对基因组的修饰可能会影响到细胞的重编程。最初的iPSCs是通过反转病毒或者慢病毒载体导入特定基因获得[32,33]，这种诱导因子的引入和对基因组的整合，可能导致细胞染色体的修饰，反转病毒载体的引入，可能引起原癌基因的激活，这些给iPSCs的临床应用带来巨大的阻碍。近年来，大量的研究集中在如何在不引起基因组改变的条件下获得iPSCs。随着研究的深入，iPSCs的诱导因子从最初的4个逐步简化至1个[41-44]，重编码方法也从最初的反转病毒载体介导，发展到后来的腺病毒介导、DNA载体介导、mRNA转染、重组蛋白转导等方法[45-48]。较于病毒载体介导方法，DNA载体介导虽然相对安全简便，但仍存在基因组重组风险，且重编码的效率极低；mRNA的应用可获得较高的重编码效率，但技术相对复杂；重组蛋白技术涉及到蛋白重组及纯化技术，对实验室技术要求较高且实施成本较高，但其高度的安全性在日后的应用中仍然值得考虑[49,50]。

四、结论

研究表明，mESCs和hESCs均可以在体外分化成为单倍体雄性生殖细胞，但ESCs由于涉及到SCNT技术和胚胎等伦理问题，其临床应用受到了极大的限制。相比之下，iPSCs源于自体细胞，逃开了胚胎来源的伦理问题，是目前唯一可以建立患者特异性疾病研究模型的资源。目前，已有研究表明，iPSCs不仅可以在体外分化成体细胞系，也可以分化成生殖细胞系。如果能利用无精子症患者体细胞体外培养iPSCs，可以尝试建立男性无精子症疾病原因筛查的模型[51]；同时，利用患者iPSCs诱导其分化为有功能的雄性单倍体细胞，为不孕症夫妇的IVF治疗提供材料，将为男性不育患者的治疗提供一个新的思路。

胚胎干细胞; 多能干细胞; 精子;细胞分化

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（2014-06-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.017

R 698.2