ATP6V0A2基因变异影响弹性纤维合成的机制研究进展

李无言, 王佳琦, 郭 鑫

综 述

ATP6V0A2基因变异影响弹性纤维合成的机制研究进展

李无言, 王佳琦, 郭 鑫

ATP6V0A2基因； 弹性纤维合成； 皮肤松弛症

皮肤松弛症(congenital cutis laxa, CL)是一类因体内弹性纤维合成或分泌异常而导致身体各部位皮肤呈早衰样病变的疾病。皮肤松垂、弹性缺失和以面部为主的身体各部位皮肤出现与年龄不符的衰老征象是该病最主要的临床表现。CL多为遗传性，国内外也有重症感染或炎性疾病后出现获得性皮肤松弛的病例报道[1-2]。 目前，遗传性CL依照基因突变位点及遗传方式不同可分为5型：常染色体显性遗传性，突变定位在编码弹性蛋白的ELN基因；伴性遗传性，突变定位在Xq13.3上的ATP7A基因；常染色体隐性遗传Ⅰ型，该型由Fibulin5或Fibulin4突变引起；常染色体隐性遗传ⅡA型，主要由ATP6V0A2突变导致；常染色体隐性遗传IIB型，突变主要定位在PYCR1基因上[3-4]。 在各型遗传性CL中，常染色体隐性遗传性(autosomal recessive cutis laxa, ARCL)是发病率最高且临床表现最复杂的类型[5]。 各型基因突变均因在不同程度上影响到弹性蛋白分泌和弹性纤维构建，而出现皮肤松弛、疝气、体内管腔结构憩室或脏器下垂等结缔组织乏弹性的临床表现。研究发现，ARCLIIA型以基因ATP6V0A2突变为主要病因，以全身广泛性皮肤松弛、囟门闭合延迟、生长发育迟缓为突出特征[2]。笔者总结并学习了近期对ARCLIIA型患者的分子生物学研究及其突变影响弹性纤维发育的机制，并对ATP6V0A2基因编码蛋白作用位点V-ATPase的生理功能及弹性纤维合成途径进行回顾。

1 基因的定位与功能

ATP6V0A2是定位于12q24.31的正链转录外显子基因，包含49 438个碱基对，其起始碱基距端粒约124 196 865 bp，编码组成囊泡型ATP驱动型质子泵(vacuolar-H+-ATPase，V-ATPase)的a2亚基[6]。 V-ATPase，顾名思义，通过水解ATP产生能量耦联激活氢离子传送通道，把氢离子从细胞浆传送至细胞里的各种囊泡内，这些囊泡既包括囊性细胞器官如内质网、高尔基体、溶酶体等，也包括细胞产生的分泌囊泡及胞内物质交换囊泡。 V-ATPase作为氢离子转运体在胞浆及胞内器官的酸碱平衡维持及胞内物质转运上起到了巨大的作用。同时其分布具有广泛性和多功能性，V-ATPase的功能与多种生理行为如胞内外源性毒素排出、肾小管尿液酸化、破骨与骨质吸收、成年人脊椎再生能力、精子成熟与储存有密切关联[7-8]。 Hucthagowder等[9]指出，V-ATPase的变异同样是造成常染色体隐性遗传性皮肤松弛症Ⅱ型A, Debre′ type (autosomal recessive cutis laxa type 2A, ARCL2A )患者产生皮肤松弛症状的重要原因。

V-ATPase由两大结构域V0与V1构成，被一个由8、9个穿膜螺旋分子和一胞浆内N端脂蛋白组成的中心柱连接[10]。 V1位于膜外，经化学定量法测得由8个不同的亚基及3个ATP结合位点构成，是酶结合并水解ATP产生能量的结构[8]。V0镶嵌于膜上，是由6个亚基构成的氢离子通道复合体。各亚基在生物体内呈动态的分解与聚合平衡，该平衡既受RAS/cAMP/PKA通道影响，也受胞外环境如pH、渗透压、糖浓度影响[11]。聚合的过程也是储存ATP与转运质子的过程。ATP在V1中水解产生的能量催动中心柱螺旋结构带动中心柱旋转打开V0的氢离子通道口，实现胞浆内和囊泡内的质子交换。链接两大结构域的中心柱也被称为a亚基，它具有4种同分异构体的表达。除了a4，其余3型a亚基在生物体内广泛表达并且相互覆盖[12]。 Fischer等在最近的研究中证实，V-ATPase的a2亚基定位主要集中在高尔基体上，并且在ATP6V0A2变异患者的表皮成纤维细胞中缺失[13]。

2 弹性蛋白的翻译与修饰、沉积过程

弹性纤维由两大蛋白质成分构成，即弹性蛋白和微丝支架。弹性蛋白是由其可溶性前体弹性蛋白原(tropoelastin, TE)经集合和桥连后形成。TE是ELN基因翻译的主要产物，大小为60～72 kDa[14]。 TE的C-端是影响其聚集成弹性蛋白的重要一级结构，因为该端存在由两个半胱氨酸残基形成的二硫键，若该键被破坏甚至C-端被去除，则TE聚集成弹性蛋白的过程将直接受到影响。TE被转运至细胞外后相互间结合成弹性蛋白，这个自发的结合过程被称为凝聚。凝聚后的弹性蛋白多为坚实的球状小体，直径在几微米到十几微米之间，并被弹性蛋白结合蛋白(EBP)锚定在细胞膜上构建集合位点。在集合位点多个弹性蛋白继续通过离子键相互集合至达到一定的分子量后EBP断开，弹性蛋白被释放入胞外基质中，在赖氨酰氧化酶的作用下，进一步通过相互交联巩固连接强度，然后附着于微丝形成的骨架上完成弹性纤维的合成过程[15]。

体内绝大多数的弹性纤维在胚胎发育时期合成，并且这些弹性纤维被认为能为结缔组织提供终生的弹性，所以弹性纤维的合成在成人时期非常少[16]。 成人后新合成的弹性纤维无法形成正常的3D结构，因此非常脆弱[17]。

3 突变导致皮肤松弛的分子生物学研究

3.1 ATP6V0A2对TE转运机制产生障碍

3.1.1 高尔基体内酸碱度改变 Hucthagowder等[9]的研究发现，ARCLIIA患者的皮肤成纤维细胞存在TE修饰和分泌障碍。通过免疫荧光染色发现，患者的成纤维细胞中存在大量高尔基体碎片以及异常运输囊泡的聚集，并且洛霉素A诱导实验(brefeldin a treatment)也表明存在高尔基体来源的运输小体降解延迟现象[9, 18]。正常情况下，TE合成后会通过基本分泌途径被快速释放到胞外。分泌过程的正常执行依赖于囊泡内酸性环境，故该过程可被洛霉素A或者氯化铵抑制。洛霉素A会阻止V-ATPase功能而影响质子向囊泡内转运，而氯化铵直接中和囊泡内酸。 TE蛋白具有双相性。当TE浓度、离子强度、温度和周围pH升高时，TE加速转化为凝聚相，进而产生高密度的弹性蛋白，形成正常的弹性纤维沉积于真皮组织。凝聚相在中性环境中出现在37 ℃，而在酸性环境中出现在40 ℃。 该机制保证了正常体温下TE在囊泡中呈溶解相因而便于运输，但在胞外环境中呈凝聚相而更易形成弹性纤维。所以，ATP6V0A2的突变直接导致囊泡内pH的升高使TE提前凝聚，影响其正常转运并沉积在高尔基体等胞内囊泡内[19]。

3.1.2 糖基化障碍 在各种翻译后修饰形式中，糖基化是最常见的蛋白质共价修饰。糖基化是通过酶促反应使单糖或多聚糖或者脂类经共价键连接于初生蛋白的过程。这一过程涉及诸多细胞功能如免疫反应、蛋白质折叠、修剪及运输等。 在内质网中初生蛋白被合成、折叠，被转入内质网的多聚糖修饰后在高尔基体内进一步成熟。这个过程不仅需要多聚糖转移酶、糖苷酶及基板的精确定位，更需要被高效准确调节的双向胞内细胞间囊泡运输[20]。 糖基化种类繁多，最常见的包括3大类：-N-糖基化的糖类或其他附件连接到天冬酰胺残基上； O-糖基化的附件连接于丝氨酸或苏氨酸的羟基上；C-糖基化通过C-C键连接于色氨酸的第二碳原子上[21]。迄今为止发现的由ATP6V0A2功能缺陷导致的是N-糖基化障碍和O-糖基化障碍。其具体机制仍不明确，目前提出两种假设，其一是V-ATPase活性降低导致高尔基体内酸碱平衡影响了多聚糖转移酶的活性；其二是由Mayer等提出的V-ATPase的V0区域与膜间融合有关，其功能丧失影响了囊泡间的融合[22]。 而且，糖基化障碍的作用基因不止ATP6V0A2一种，有报道COG7-CDG、 PMM2-CDG、DPAGT1-CDG以及ALG8-CDG 的突变，均可导致CDG症状出现[23]。

3.2 ATP6V0A2患者成纤维细胞转化生长因子表达增高

2001年，T Saito等报道正常人成纤维细胞培养上清液中的活性转化生长因子浓度在检测阈值以下。 多名学者都在影响胞外基质形成的综合征----其中包括常染色体显性遗传皮肤松弛症(autosomal dominant cutis laxa, ADCL)和ARCL-中发现TGF-β表达上调，其患者成纤维细胞培养上清液中可检测到转化生长因子[24-26]。 Callewaert提出成纤维细胞表达的变异型弹性蛋白极大地增强了TGF-β信号；也有学者在ARCLⅡ患者的成纤维细胞培养上清液中测得TGF-β1及其未经校准的下游信号。关于TGF-β表达增强的原因目前主要推测有两种，即胞外基质(extracelluar matrix, ECM)成分破坏和LTBPs的受损。LTBPs是大延迟复合体(large latency complex)的一部分，与TGF-β在ECM上的定位有关[27-28]。

TGF-β1可促进成纤维细胞合成弹性纤维。Katchman等[29]指出，TGF-β1可增加CAT等弹性蛋白翻译激活因子促进TE的转录 。Zhang等[30]发现，TGF-β1可以通过激动Smad、PC、PLC等信号通路来减少或改善皮肤松弛症患者的成纤维细胞中TE mRNA的不稳定性。 Dial等发现，TGF-β1会降低胞外基质中弹性纤维蛋白酶MMP-2、MMP-9水平。TGF-β1可通过调节TE 前体活性、mRNA稳定性，弹性纤维降解之间的平衡来促进弹性纤维合成[31]。因此笔者认为，TGF-β1在ARCLII患者的成纤维细胞中得到高表达是机体对不正常胞外组织进行的负反馈调节。但是有学者认为，与定位在胞内溶酶体膜上的ATP6V0A2功能缺陷使溶酶体与其他囊泡器官循环障碍有关，如Chen等[32]发现B淋巴细胞溶酶体的循环障碍增强了Smad2磷酸化，也可能是TGF-β水平增高的原因之一。 然而也有学者发现，在胚胎肺成纤维细胞和胚胎动脉细胞中，TGF-β1增加CAT活性。而在皮肤成纤维细胞中作用不明显。这些发现暗示，TGF-β1在激活弹性蛋白转录的作用上具有组织特异性(VM Kähäri, 1992年；V Marigo, 1993年)。 Janson等[33]的最新实验结果也间接证明了这一点，人皮肤组织中培养出的乳突状成纤维细胞无法在TGF-β刺激下分化出网状成纤维细胞，而培养基培养出的乳突状成纤维细胞则可以。所以，TGF-β1升高对于皮肤中弹性纤维合成的影响仍需进一步研究。

4 前景与展望

遗传性CL的基因突变及其引起的连锁性分子生物学变化的研究，对于揭示正常皮肤在弹性纤维合成及构建方面具有重要作用。虽然ATP6V0A2突变使V-ATPase的a2亚基异变，影响成纤维细胞的分泌及合成弹性纤维功能已经得到证实，但是，由其他因素导致的V-ATPase结构变异与广泛性皮肤松垂表型的关联性，仍然缺乏证据。所以，目前的实验结果仍然无法恰当地解释该突变与临床表型的因果关系。另外，迄今为止报道的CL病例发病阶段不同，病情轻重各异，各型之间外显症状相互重叠，仅ARCLIIA患者中被报道的临床症状严重程度就存在极大差别[9]。 因此，为什么该基因突变所引起的外显病症具有如此显著的组织特异性，仍需大量工作进行证实。而在瘢痕学方面，目前已知遗传性CL的瘢痕愈合过程，与正常人相同，对于能够耐受手术的患者，整形外科治疗对其心理维护及社会融合有很大意义。然而正确的诊断对于遗传性或获得性CL患者是否可以选择整形外科治疗至关重要，因为在某些具有皮肤松弛或超弹性的综合征，如Marfan综合征、弹性纤维假黄瘤、ED综合征等皮肤切口瘢痕有增生倾向，手术效果往往适得其反[2,34]。 皮肤同样在弹性纤维结构或数量异常的特征中，导致和不导致瘢痕增生的条件的研究，可能会对揭示瘢痕增生机制给出提示因素。

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100144 北京，中国医学科学院整形外科医院 整形三科

李无言(1988-)，女，山东济南人，硕士研究生.

王佳琦，100144，中国医学科学院整形外科医院 整形三科，电子信箱：wangjiaqi@psh.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.015

2014-04-16)